细菌CGA的泛素样结合增强了抗流量防御

　　基于以下序列在商业上合成了两侧的侧翼序列的大约1,000个基本对（BP）的区域：E 。Coli TW11681（GenBank：cp035855.1，237581 ，2375815-2381149）
，V.Cholerae（Genbank：genbank：aee003852）
。P. eruginosa，（AXQR01000012.1 ，1255165–1250237）
，肠杆菌（GenBank：JCKK01000002.1，2262747–2268381）。在其CGAS蛋白的N末端合成了霍乱 ，铜绿假单胞菌和肠杆菌的构造 。使用Gibson Assembly20与P15A起源和氯霉素耐药基因组装
，从PLYSS质粒放大了PCR
。通过将质粒主链的末端与PCR（以添加同源序列）和Gibson Assembly 20来组装空的矢量控制。这些基因中的点突变和表位插入是使用定位的诱变21创建的 。将质粒转化为DH5α细胞（Lucigen，60602） ，并使用Sanger测序验证了扩增的质粒
。将质粒转化为大肠杆菌MG1655（ATCC，47076）。 　　细菌培养物在LB中用适当的抗生素生长过夜 。将培养物在LB培养基中稀释
，并在600 nm（OD600）为1.0±0.2时生长至光密度。离心块状等于1 OD600的细胞的体积在0.1 mL冷藏的Dulbecco的PBS中（Sigma，D8537）重悬于
。细胞悬浮液在4°C下进行超声检查。对于某些实验 ，将DTT（1、10或100 mm）或羟胺（H2NOH; pH 7.0; 1 、10或100 mm）添加到裂解液中
，并在室温下孵育30分钟，然后添加缺乏还原剂的样品缓冲液（NOVEX ，LC2676） 。对于CGA的免疫印迹
，将样品缓冲液补充了5％β-甲醇（BME）
。将样品加热至95°C，持续2分钟 ，在桌上离心机上以13,000 rpm的速度旋转
，并用SDS-PAGE用Tris-甘氨酸凝胶解决（4-12％，NOVEX）。分离的蛋白质转移到PVDF膜上（Biorad ，1704157） 。将膜在TBST（20 mM Tris pH 7.5
，150 mm NaCl，0.1％Tween-20）中以5％BSA的形式封闭 ，然后与1：1,000稀释抗FLAG抗体（Sigma）孵育，然后用1：5,000稀释抗Mouse IgG
，然后用HRP抗体，HRP-linked二级抗体（HRP）抗体（HRP）抗体（HRP）抗体（HRP）抗体抗体（细胞）（706）706767076707070707070707070.706
。使用Biorad Chemidoc（Image Lab Touch）收集蛋白质凝胶和免疫印迹图像。使用Biorad Image Lab软件分析数据 。 　　这项研究中使用的所有噬菌体均从ATCC（目录NOS）订购：P1（25404-B1） ，T2（11303-B2）
，T4（11303-B4），T5（11303-B5） ，T6（11303-B5）
，T6（11303-B6）和Lambda（23724 B2）
。所有噬菌体均在大肠杆菌MG1655菌株中繁殖，该噬菌体也从ATCC获得（47076）。首先 ，大肠杆菌宿主细胞的隔夜培养物在LB（Miller）肉汤（Sigma
，L3522）的37°C中生长，并摇动（220 rpm） 。在补充了5 mM MGCL2
、5 mM CaCl2和0.1 mM MNCL2的新鲜LB培养基中 ，将隔夜培养物稀释100倍
。将细菌与噬菌体接种并培养直到细胞完全裂解。将几滴氯仿添加到培养基中
，并以4,000 rpm离心10分钟以去除碎屑 。将噬菌体转移到新的管中，加入几滴氯仿 ，并将噬菌体存储在4°C下。这些股票的滴度使用下面描述的小型斑块测定法确定
。 　　小抽水斑块测定法用于确定噬菌体滴定滴定和电镀效率以及图书馆筛选。为了制备接种的顶级琼脂，将120 µL的隔夜细菌培养物添加到5 mL熔融的顶级琼脂（LB（Miller）
，0.5％琼脂，5 mM MGCL2 ，5mm CaCl2
，5mm CaCl2和0.1 mM MNCL2下50°C），在50°C下快速混合并混合在Petri Dish上 。将板在室温下冷却约30分钟
。为了确定噬菌体滴定和电镀效率 ，用LB（Miller）肉汤和移液器（每滴5 µL）制备了十倍的噬菌体量稀释液
，并用多镀金移液器将其放在冷却的顶部琼脂上。将液滴干燥约30分钟，然后倒入培养皿并在37°C下孵育过夜 。为了量化斑块形成单位（PFU） ，从最低的稀释液中计数单个斑块和可见裂解
。在某些情况下
，单个斑块无法区分，裂解环被计为10个斑块。选择样本量以可靠地确定组之间的差异 。鉴于较大的影响 ，我们进行了一式三份或四倍体的实验
，以证明可重复性
。这项研究不是必需的，因为数据具有强大的可重复作用 ，并且在手稿中报告了原始数据。GraphPad Prism用于数据分析 。 　　来自大肠杆菌TW11681的CBASS操纵子的细菌CGA（DNCV，残基2-432）和CAP2（残基2-589）蛋白用于体外结合测定
。细菌CAP3（残基1-156）和由气体（残基2-432）–CGA（残基1-432）蛋白质构建的串联CGA
，用于大肠杆菌TW11681的CBASS操纵子，用于体外脱糖分子。Vs.4（残基1-88）和Vs.4点突变体来自噬菌体T4的结合测定和晶体学 。所有蛋白质均表示为BL21（DE3）Plyss E. coli中的Sumo融合 ，并用含有感兴趣基因的改良PET-SUMO载体转化。对于所有蛋白质
，将细菌细胞在37°C的肉汤（RPI）中生长至0.6的OD600，然后在18°C诱导蛋白质表达过夜过夜
。通过离心收集细菌培养物 ，并在-80°C下冷冻颗粒。将细菌CGA
，CAP2和VS.4重悬于结合缓冲液（20 mM Tris pH 7.4、500 mM NaCl，20 mM咪唑和2 mM Bme）中 ，并用0.2 mM苯基甲基硫磺酰氟氟氟氟氟化物（PMSF）作为蛋白酶抑制剂 。通过超声处理裂解细胞悬浮液
，并离心以去除细胞碎片
。将澄清的上清液应用于在结合缓冲液中平衡的Ni-硝基三环酸琼脂糖（Ni-NTA）树脂，并在4°C下与轻微旋转孵育约1小时。将树脂用超过10 mL的结合缓冲液洗涤3次 。用20 mM Tris pH 7.4 ，300 mm NaCl
，200 mm咪唑洗脱结合的蛋白质
。SUMO -CGA -CGAS蛋白浓缩并在-80°C下冷冻。将其他蛋白质用20 mM Tris pH 7.4，300 mm NaCl稀释 。将DTT添加到1 mm的最终浓度中 ，并在4°C下使用ULP1蛋白酶（每毫克蛋白质0.01 mg蛋白酶）切割SUMO标签
。通过串行自旋过滤将缓冲液交换为20 mM Tris pH 7.4和300 mM NaCl。要删除来自表达蛋白的Sumo Tag和ULP1（两个都有HIS6标签）， 通过用20 mM Tris pH 7.4和300 mM NaCl平衡的Ni-NTA树脂通过Ni-NTA树脂 。对于CAP2和CAP3
，将蛋白质浓缩并在-80°C下冷冻
。对于细菌CGA和Vs.4，在S200 10/300柱上的尺寸 - 排斥色谱法中收集了蛋白质 ，该蛋白具有20 mm Tris pH 7.4
，150 mm NaCl，1 mm dtt。浓缩纯化的蛋白质并在-80°C下冷冻 。通过SDS -PAGE验证了纯度 ，并通过280 nm的紫外吸光度测量浓度。 　　为了纯化CAPV（残基2-356）
，将冷冻细菌颗粒解冻并重悬于结合缓冲液中（50 mm磷酸盐缓冲液pH 7.4 、300 mM NaCl，20 mM咪唑 ，10％甘油和2 mm Bme）
，用0.2 mm pmsf
。通过超声处理裂解细胞悬浮液，并离心以去除细胞碎片。将澄清的上清液应用于已在结合缓冲液中平衡的Ni-NTA树脂 ，并在4°C下温和旋转约1小时孵育 。将树脂用超过10 mL的结合缓冲液洗涤3次
。用补充咪唑的结合缓冲液洗脱结合的蛋白质
，最终浓度为200 mm。将蛋白质用50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4
、300 mM NaCl和10％甘油稀释 。将DTT添加到1 mm的最终浓度中，并在4°C下使用ULP1蛋白酶（每毫克蛋白质0.01 mg蛋白酶）切割SUMO标签
。通过连续自旋过滤将缓冲液交换为50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4、300 mM NaCl和10％甘油。为了从CAPV中删除HIS6-SUMO标签和HIS6-ULP1 ，通过使用50 mm磷酸盐缓冲液pH 7.4 、300 mM NaCl和10％甘油平衡的Ni-NTA树脂通过Ni-NTA树脂 。将纯化的CAPV浓缩并在-80°C下冷冻
。通过SDS -PAGE验证了纯度，并通过280 nm的紫外吸光度来定量浓度。 　　为了测量T4感染裂解物中的CGAMP水平
，使用了THP1 Lucia ISG细胞（Invivogen） 。使用形态和功能测定（在IRF诱导型启动子的控制下的分泌荧光素酶（Lucia）记者基因的表达）对该细胞系进行身份验证，并且未对支原体污染进行测试
。为了制备裂解物 ，将含有空载体的大肠杆菌MG1655细胞的培养物或大肠杆菌CBASS操纵子具有指示点突变的培养物
，在LB中以5 mM MGCL2，5 mM CaCl2和0.1 mM MNCL2在37°C下以5 mM MGCL2 ，5 mM CaCl2和0.1 mM MNCL2生长（220 rpm）。当培养物达到1.0的OD600时
，它们以大约10的多种感染感染了噬菌体T4，并在37°C下培养 ，摇动1小时（220 rpm） 。样品是沉淀的
，并通过倒掉去除培养基。将细胞颗粒重悬于50μlPBS中，将其加热至95°C 10分钟 ，然后以20,000g离心10分钟以去除细胞碎片
。从这些裂解物中
，将5μL添加到45μLRPMI1640培养基中的2.25×105 THP1 Lucia ISG报告细胞中，并补充了10％FBS ，并补充了50 ng ML -1重组蛋白酶蛋白蛋白O（PFO）。然后将样品在37°C下孵育16小时 。将十二个微量的这种培养物转移到含有1μM鞘嗪（金生物技术），50 mM Tris -HCl
，pH 7.0
、50 mM NaCl，20 mM EDTA和20％甘油的缓冲液中
。使用Clariostar Microplate读取器和Clariostar读取器软件（BMG LabTech）在不透明的96孔板中测量发光。纯CGAMP（0.01至30μm）用于获得标准曲线 。 　　先前描述的CAPV8的荧光测定法用于在P1感染裂解物中定量3' ，3'-cgamp
。为了制备裂解物
，将含有空载体的大肠杆菌MG1655细胞，大肠杆菌CBASS操纵子和大肠杆菌CBASS操纵子（含有点突变（CGASΔG432））在Lb中生长 ，LB在LB中生长
，使用5 mm MgCl2，5 mm Cacl2和0.1 mm Mm Mncl2和0.1 mm Mncl2 AT 37°C（220）lb生长。当培养物达到1.0中的OD600时 ，它们以2种感染的多种感染感染了噬菌体P1
，并在37°C下培养时，摇动（220 rpm） 。在感染时 ，从每种培养物中取100μL作为0分钟的时间点
，并在液氮中冷冻
。从每种培养物中以10分钟的间隔从40分钟开始，并在感染后100分钟结束 ，并在液氮中冷冻。将样品加热至95°C 10分钟，超声处理并以20,000克离心10分钟以去除细胞碎屑 。从这些裂解物中
，将10 µL与10 µL纯化的重组CAPV混合，如下所述测量CAPV磷脂酶活性
。 　　将CGAMP（1 µM）与10 µm的指示重组VS.4蛋白混合 ，总体积为10 µL
，然后将其与10 µL纯化的重组CAPV蛋白（PBS中的2 µm和1％NP-40）混合，并在室温下孵育10分钟。将荧光蛋白酶丁酸酯（Cayman Chemical ，19592）溶解在DMSO中
，并在添加到每个样品之​​前稀释至64 µm，在PBS中稀释至1％NP-40（30 µL） 。板在室温下在Grenier 96孔板（655083）的室温下开发 ，直到形成强烈的荧光信号（约30分钟）
，用ClarioStar读取器（BMG Labtech）读取具有激发和吸收波长为560 nm和595 nm的，并分别读取。 　　T4噬菌体库的构建遵循先前建立的协议22
。简而言之 ，培养了约1011 PFU T4噬菌体的股票（请参阅“噬菌体种植 ”）
，并使用Amicon滤光片（100 kda MCO; ACS510024）和浓度浓缩到1 ml。通过将0.2 ml浓缩的噬菌体与0.4 ml磷酸盐 - EDTA缓冲液（500 mM KH2PO4 pH 6，5 mM EDTA） ，0.8 mL无菌双径液的水混合，将噬菌体化学化化学诱变 。0.28毫升4 M NaOH
，并将水蒸馏至2.5毫升）
。通过用PBS代替羟胺溶液来完成以监测诱变剂对生存力的影响的控制反应。将反应在37°C下孵育约48小时 。使用小斑块测定法确定了诱变和对照噬菌体的生存能力（如上所述），发现诱变的噬菌体的生存能力为对照的0.1％ ，表明足够的诱变
。将诱变的噬菌体透析在4°C下用噬菌体缓冲液在Pierce Slide-a-Lyzer盒中透析24小时
，并在中途进行缓冲液变化。 　　为了隔离单个突变体，在120μl大肠杆菌MG1655的等分试样中进行了十倍稀释的噬菌体 ，该噬菌体是在一夜之间培养的 。将噬菌体/细菌溶液与熔融顶琼脂（LB（Miller）
，0.5％琼脂，5 mM MGCL2、5 mM CaCl2和0.1 mM MNCL2在50°C下）混合 ，然后快速混合
，然后倒入培养皿中
。将板在室温下冷却约30分钟，然后在37°C下孵育过夜。使用无菌牙签挑选孤立的斑块 ，并悬浮在96孔板的LB中 。将这些含噬菌体的溶液移到了已被大肠杆菌MG1655接种的顶部琼脂表面上（请参见上文）
，含有无CBASS（空载体），野生型CBASS（CBASS）或CAP2灭活CAP2突变（CBASS CAP2 C493A/C493A/C496A）
。仅在空载体板上形成斑块的突变体通过牙签挑选并重复以确认表型。培养了具有可重现表型的克隆并滴定 ，以确定其在此屏幕中使用的所有三种细菌上的电镀效率（见上文） 。 　　为了确定感兴趣的突变体的基因型，根据制造商的说明
，使用试剂盒（Norgen Biotek，NC0690454）分离噬菌体DNA ，包括可选的DNase治疗步骤。这些噬菌体突变体和父母野生型T4噬菌体的整个基因组使用Illumina Novaseq 150 bp配对末端读数确定
。测序数据可在Bioproject PrjNA931786下的序列读取存档（SRA）中获得。通过质量控制对读数进行过滤
，并使用seqman ngen（DNASTAR）组装 。 　　为了验证此屏幕的最高命中，使用PCAS9（Addgene ，42876）和PCRISPR（Addgene
，42875）23,24将噬菌体T4的Vs.4基因击倒
。Chopchop25用于设计CRRNA靶向vs.4。将这些序列与盒子一起克隆到PCRISPR中，以遗传插入vs.4基因座的T4基因组中 。该盒子在报告基因的两侧（从PUC19克隆的LacZ）的两侧包括大约500个同源性对4
。接种大约105个野生型T4噬菌体 ，将含有PCRISPR的大肠杆菌DH5α（100 µL）含有PCRISPR（基因组RNA+供体）接种
，并添加到熔融的0.5％LB顶部琼脂中，其中含有5 mm MGCL2 ，5 mm MM CACL2和5 mm CaCl2和0.1 mm MMNCLCT ANCL2与适当的抗体和plate Anlbl2一起浇注
，然后浇筑了COPER COLLIB和POUTIBITS，pOVER和POUTIBITS ，然后37°C。第二天，将斑块拾取并在大肠杆菌MG1655上重新镀以去除质粒的背景 。通过PCR筛选该板上的斑块
，然后在琼脂糖凝胶上分离DNA
。Vs.4敲除使用Sanger测序确认。 　　与3'3'-cgamp（Invivogen）复合物中的Vs.4的晶体在悬挂的液滴中生长在含有7％PEG8000 、0.1 M咪唑pH 6.3和0.2 mm乙酸钙的储层上 。以1.2：1摩尔比以1.2：1的摩尔比，将CGAMP升级到蛋白质溶液中
。悬挂液含有1μl与1μl储层溶液混合的复合物。晶体通过在闪光冷冻之前转移到补充了17.5％乙烯乙二醇的储层溶液中 。在Argonne国家实验室的高级光子源中收集了衍射数据 ，波束线19-ID
，波长为1.0448Å。在100 K处的波长为1.0448Å
。将数据集成并使用HKL-3000进行整合至2.0Å，并使用vS.4使用Alphapaffold26,26,26,28,28,28的预测结构进行了分子替换 ，并通过分子替换将分子替换为2.0Å。该结构通过迭代的精致和使用Phenix和COOT29,30的迭代回合进行了完善 。最终模型的Ramachandran统计数据为99.01％
，允许0.99％和0.00％的离群值
。最终模型的冲突分别为6，该模型具有1.4％的侧链异常值。PISA31分析（在PDBEPISA网站上在线访问）用于确认第四纪结构分配 。Pymol用于创建数字
。 　　为了在体外重新建立CGAS与CAP2的共价附着 ，将这些重组蛋白（上述纯化）在50 mM HEPES pH 7.5
，300 mm NaCl，5 mM TCEP（调节至7.0） ，1 mm Cacl2
，20 mm Cacl2，20 mmmgcl2和10 mmmgcl2和10 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm中。将混合物在37°C下孵育30分钟 。通过在70°C下添加LDS样品缓冲液（Nupage）并加热10分钟来淬灭反应
。在没有还原剂的情况下 ，通过SDS -PAGE分离溶液中的蛋白质，并用Coomassie Blue染色。为了测试在体外形成的偶联物的活性
，在50 mM HEPES pH 7.5、300 mm NaCl，5 mM TCEP（调节至7.0） ，1 mM CaCl2
，1 mm CaCl2
、20 mM MGCL2和10 mm ATP（pH调节至7.0）和30分钟的377°C. CACL2和10 mm ATP（pH调节至7.0）中 。根据制造商的说明，用Zeba旋转脱盐柱 ，7K MWCO
，0.5 ml（Thermo Scientific）脱皮尔，并用10 mM MGCL2换成PBS
。在将ATP和GTP添加到最终浓度为1 mm之前 ，将样品稀释在三倍的稀释系列中。将反应37°C孵育30分钟
，然后通过在95°C加热2分钟来淬灭反应 。如上所述，使用THP1 Lucia ISG细胞测量CGAMP ，如“测量感染裂解物中的CGAMP
”中所述。 　　为了测试CAP3在体外是否充当CGAS异肽酶
，将重组SUMO -CGA -CGAS或FLAG IP弹出物在20 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl，20 mM MGCL2 ，20 mm MMMGCL2 、20 mm Zncl2
、20 mm Zncl2、20 mm Zncl2 、1 mm dtt中混合
。将混合物在37°C孵育120分钟。为了进行蛋白质印迹分析，通过在80°C下添加LDS样品缓冲液（Nupage）和加热10分钟来淬灭反应 。溶液中的蛋白质通过SDS-PAGE分离
，并用Coomassie Blue染色或用抗FLAG抗体进行免疫印迹
。对于CGAS活性测量，在将ATP和GTP添加到最终浓度为1 mm之前 ，将用CAP3处理或仅缓冲液对照处理的FLAG IP弹rate稀释。将反应37°C孵育120分钟
，然后通过在95°C加热2分钟来淬灭反应 。如上所述，使用THP1 Lucia ISG细胞测量CGAMP ，如“测量感染裂解物中的CGAMP”中所述
。 　　Weblogo32用于显示先前鉴定的CBAS Operons12的CGA的C末端序列的序列徽标。 　　使用HHPRED33识别vs.4的同源物
，搜索phrogs_v4 database34 。发现Phrog 717包含Vs.4同源物
。使用Clustal Omega35对齐该词的序列，并使用默认设置生成系​​统发育树。Itol：使用Life36的互动树显示系统发育树 。Weblogo32用于显示多个序列比对
。 　　使用Microcal ITC200 Control Software（GE） ，用VP-ITC微氧化胜地（GE Healthcare）确定VP-ITC微氧计（GE Healthcare）之间的VSS.4/vs.4突变体和3'3'-CGAMP之间的结合亲和力。Vs.4透析3 L的20毫米Tris
，150毫米NaCl过夜 。将CGAMP（Invivogen）重悬于用于透析的缓冲液中。滴定在20°C下进行
。总共2分钟的间距时间总共进行了21次注射。通过NITPIC整合了滴定轨迹，然后使用具有SEDPHAT37,38的CGAMP结合位点的浓度拟合曲线 。使用Gussi39制备这些数字
。 　　使用Rayleigh干涉仪和软件proteomelab（Beckman – Coulter）在20°C下用Optima XL-I分析性超级离心机（Beckman – Coulter）确定了Vs.4和3'3'-CGAMP的低聚状态。Vs.4透析3 L的20毫米Tris ，150毫米NaCl过夜 。将CGAMP（Invivogen）重悬于用于透析的缓冲液中
。参考部门在20毫米Tris
，150 mm NaCl中填充90 µm CGAMP。样品扇区用45 µm，15 µm或4.5 µm vs.4在20 mm Tris ，150 mm NaCl中填充90 µm CGAMP 。将样品以50,000 rpm离心，扫描收集到不再观察到溶质迁移为止
。使用Sedfit40拟合曲线。使用Gussi39制备这些数字 。VS.4突变体的寡聚态通过如上所述制备突变体来确定
。对于这些实验
，在20 mM Tris和150 mM NaCl中填充了每种突变蛋白15 µm的扇区。 　　为了鉴定共价修改为CAP2的蛋白质，通过使用适当的抗生素在LB中在LB中过夜 ，可以获得野生型和非活性CAP2（C493A/C496A）的细菌培养物的全细胞裂解物样品 。将培养物稀释在LB培养基中
，并生长至1.0的OD600。离心块状等于1 OD600的细胞的体积在0.1 mL冷藏的Dulbecco的PBS中（Sigma，D8537）重悬于
。细胞悬浮液在4°C下进行超声检查。将样品缓冲液（无还原剂）（NOVEX ，LC2676）添加到每个样品中
，并将样品煮沸 。 　　为了鉴定CGA共轭位点，在LB（Miller）中生长了5 mM MGCL2 ，5 mM CaCl2和0.1 mM MNCL2在37°C到1的OD600
，并通过4,000g在4,000g处于4°C中的4,000g phections and t4 phage Incodection 10分钟以1,000g的感染，或在T4 phection contection cibection t4 phectionction中立即收集OD600
。通过离心收集前40分钟。将细胞沉淀重悬于相等质量的裂解缓冲液中（50 mm Tris pH 7.4 ，250 mm NaCl
，0.5％CHAPS），并通过滴入液氮中冷冻 ，然后使用RETSCH MM301 MIXER磨机在30 Hz的10个Hz中被液态固定液体固定液含量2.5分钟，在液态下被固定液含量为2.5分钟 。将冷冻细胞粉末悬浮在裂解缓冲液中
，用PT 10-35 Polytron（Kinematica）均匀地均匀，并在4°C下在10,000g下离心10分钟
。上清液用于与抗Dykddddk磁琼脂糖（Pierce ，A36797）的亲和力纯化。通过在LDS样品缓冲液中煮沸（Nupage）将蛋白质样品洗脱 。 　　将蛋白质样品在10％Nupage Tris-甘氨酸凝胶（Thermo Scientific）上分离
，并用SimplyBlue Safestain（Thermo Scientific）可视化
。切除蛋白质带并在50 mM碳酸氢铵（ABC）和50％乙腈（ACN）中去除蛋白质带10分钟。将凝胶切片在100％ACN中脱水，并在50 mM ABC加5 mM DTT中再生30分钟 。加入碘乙酰胺（50毫米）60分钟
。将凝胶片脱水 ，在ABC中再生
，并在37°C下在50 mM ABC中与12.5ngμl -1胰蛋白酶（Promega）孵育前脱水。将所得的肽在25°C下在1％甲酸（FA）中提取4小时，然后在0.5％FA/0.5％ACN中提取2小时 。在1％甲酸中酸化后 ，用C18 ZIP-TIP（Millipore）进一步纯化肽混合物
，并通过纳米液相色谱 - 质谱法（NLC – MS）进行分析。 　　将肽混合物在二氧化硅毛细血管发射剂中的内部包装C18柱上分离（树脂：100Å，3 µm ，Michrom Bioresources；柱：100 µM内径
，100 mm树脂长度）
。Dionex Ultimate 3000 Nanolc系统（Thermo Scientific）为LC梯度提供了0.1％甲酸为流动相位A和乙腈中的0.1％甲酸作为流动相位B。使用了以下梯度：在81分钟，87分钟b时 ，在0-15 min，35％B
，35％B，35％B ，在87分钟B. 35％B
，30％B，30％B ，30％B
，30％B，30％B ，30％B
，30％B.在108–120分钟 。在0–13.5分钟时，流速为600 nl min -1 ，在13.5–120分钟时为250 nl min -1
。 　　用纳米电喷雾离子源（带有Xcalibur软件的Thermo Scientific）在线喷洒肽洗脱液
，喷雾电压为1.5 kV，毛细管温度为250°C。高分辨率MS分析是在QECECACTIVE HF-X四极杆-Orbitrap杂交质谱仪（Thermo Scientific）上进行的 ，在数据​​依赖性模式下运行，动态排除为30 s 。全扫描MS的M/z范围为300–1,650
，分辨率为60,000，自动增益控制目标为3×106离子
。随后 ，以15,000的分辨率
，30 eV的碰撞能量和1×105的自动增益控制目标选择了前15个最激烈的离子以进行更高的能量碰撞解离片段化。 　　使用大肠杆菌菌株K12蛋白质组数据库（UNIPROT，UP000000625） ，T4噬菌体蛋白质组数据库（UNIPROT
，UNIPROT，UNIPROT ，UNIPROT
，UP000009087），E.COGASS PROTEINS（COP2） ，PES2
，COP2，使用大肠杆菌菌株K12蛋白质组数据库（UNIPROT ，UP000000625），使用E. coli菌株K12蛋白质组数据库（UNIPROT
，UP000000625），通过E. cocbass Protef;p0dtf0; capv ，p0dte9;静态修饰：半胱氨酸上的氨基甲米甲基化；可变修饰：胰蛋白酶消化后的蛋氨酸氧化
，谷氨酰胺或天冬酰胺脱氨酸和CGAS C末端残留物（Thr-met-val-ser-gly，三角洲质量为476.21735 DA）；前体质量误差：10 ppm;碎片质量误差：0.05 da;最大分解：2;肽错误发现率：1％ 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。