用一站式密码子工程进行基因组重新编码的生物

　　寡核苷酸是从具有标准纯化和脱盐的集成DNA技术中购买的。有关所有寡核苷酸和DNA构建体 ，请参见补充数据 。 　　除非另有说明
，否则所有培养物均在LB-LENNOX培养基（10 g l-1 Bacto tryptone，5 g L-1氯化钠 ，5 g L-1酵母提取物）中生长
。LB琼脂板由LB加15 g -1 Bacto琼脂组成。M9最小培养基（12.8 g l -1 Na2HPO4
，3 g L -1 Kh2po4，1 g l -1 nh4cl ，0.5 g l -1 naCl
，3 mg l -1 cacl2）用10 mHOH调节为pH 7.5 。对于噬菌体实验，由10 g l-1 tryptone ，5 g l-1 kCl和0.5 ml l-1的1 m CaCl2组成的锥虫-KCL（TK）液体培养基
。TK马虎琼脂包含10克L -1锥虫，5 g L -1 NaCl和7 g L -1琼脂。TK底琼脂包含10 g l -1锥虫
，2.5 g l -1 naCl，2.5 g l -1 kcl ，0.5 ml l -1的1m Cacl2和10 g l -1琼脂 。具有分解代谢物抑制（SOC）液体培养基的超级最佳汤中包含（20 g l -1 tryptone
，5 g l -1酵母提取物，10 mm NaCl ，2.5 mM KCl
，10 mM MGCL2，10 mM MGSO4和20 mMMGSO4和20 mm葡萄糖）
。对于蛋白质产量定量 ，很棒的肉汤培养基（TB）包含11.8 g l -1锥虫
，23.6 g l -1酵母提取物，9.4 g l -1 k2hpo4 ，2.2 g l -1 kh2po4和0.8％v/v甘油。 　　Cole1在JC411菌株中表达
，并如前所述纯化61 。商业上购买了所有其他选择性剂：碳苯甲林（50 µg mL -1），氯霉素（40 µg ml -1） ，庆大霉素（10 µg mL -1），卡纳米霉素
，卡纳米霉素（30 µg ml -1），硫酸钠（硫酸钠）（硫酸钠（Sodium）（190 µg mL -1） ，四环素（15 µg ml -1）
，湿霉素（150 µg mL -1），Zeocin（10 µg mL -1）和colicin E1（CoLe1; 〜10 µg ml -1）。 　　质粒诱导的Portmage62和重组63： - 阿拉伯糖（0.2％W/V ，PBAD启动子）
，Rhamnose（0.15％W/V，Rhab启动子）
。用四环素（5–10 ng ml -1 ，TETA可选标记）进行质粒维持。 　　NSAA掺入分析的OTS表达： - 阿拉伯糖（0.05％w/v
，PBAD启动子）和半氢环霉素（100 ng ml -1，pl teto启动子） 。 　　Bock购自Chem-Impex（00363） ，并将其溶解在LB或TB中
，最终浓度为10 mm
。PACF购自Chem-Impex（24756），将无菌水溶于50 mm的浓度 ，并以1 mm的终浓度使用。 　　所有菌株均基于recΔ1.ΔA-C321.ΔA4（MG1655DNAG.Q576A.EXOX.K28TAA.ΔTOLC.ΔPRFA.ΔMUTS::ZEO.Δ（ybhb-bioab）所有标签密码子的所有实例都转换为TAA和1,195个天然发生的TGA密码子 。 　　根据制造商的协议，使用KAPA HIFI HOTSTART READYMIX进行了可选的标记（每反应40 µL）
，并在61°C下退火
。通过Kun的寡核苷酸TM计算器（http://arep.med.harvard.edu/kzhang/kzhang/cgi-bin/myoligotm.cgi）确认了引物通过Benchling Primer Creation软件设计。使用QIAGEN PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，在30 µL DH2O中洗脱 ，并使用Eppendorf Biophotometer Plus或Nanodrop ND1000分光光度计进行定量 。为了进行分析
，用溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶进行扩增子，以确认预期的带尺寸
。 　　起始应变是标准rec∆1.ΔA（C321.ΔA） ，带有Zeocin标记盒
，可在MUTS基因座处取代氯霉素标记（补充表10）。如前所述，在YCGV和YCHF基因之间复制了YBGC-TOLQRA基因座 ，如前所述64
，以增加Cole1选择的忠诚度 。先前报道的DNAG和EXOX突变以提高MAGE效率，在起始菌株65中也存在
。从WGS中鉴定出所有包含TGA密码子的基因（补充表1；请参见下面的“ WGS和分析 ”方法）。消除TGA密码子需要法师介导的TGA转化为TAA和非必需基因缺失的策略（补充表7） 。寡核苷酸的设计如前所述30 ，从IDT订购
，并将每个池的每池总DNA总计为每池11寡核苷酸，而不管寡核苷酸的数量如何（n）（补充表1）。在培养培养之前 ，这些池用于N+1轮法师
。如前所述30进行法师。如前所述15，使用多重等位基因特异性菌落PCR（MASC-PCR）挑选并筛选了47个菌落 。同时
，将采摘的菌落种植到汇合处，将1:15稀释到150 µL的M9最小培养基中 ，然后将1：100接种到150 µl lb和M9中
，以评估生长表型（Maxod，Diblime and Flip Time和Lag Time）（请参阅“适应性分析
”）
。在随后的法师之后 ，选择了最低频率转化率和最小偏差的菌落。 　　预测在重新编码为TAA之前和之后与TGA终止密码子重叠的基因的RBS翻译速率是与先前的方案36的一致性计算的 。 　　如前所述15,62
，进行法师，Portmage和λRed介导的重组
。将细胞转移到0.1 cm的卧板中 ，电穿孔（Biorad Genepulser
，1.78 kV，200Ω ，25 µF）
，并立即重悬于3 ml lb（法师）或1 mL SOC培养基（DSDNA），在34°C下生长 ，34°C，225 rpm。对于TOLC和GALK阴性选择
，将培养物至少回收7小时，以允许在暴露于Cole1和2-脱氧核糖糖浆之前进行完整的蛋白质更新 。一旦将所有菌株偶联成最终的应变（请参见“笼组件”） ，基因组整合的λ-RED被TOLC阴性选择所取代
。为了转换背景突变和剩余的TGA密码子
，我们采用了基于质粒的单链DNA重新组合方法。- 在可抗温的质粒上表达 - 诱导的λ红衍生的重新组合机械 。对于双链DNA（DSDNA）重组，还以含有温度可抑制的质粒含有 - 芳替糖 - 诱导的CCDA抗毒素的可诱导的鼠尾草诱导的λ红元素重新组合机械表达了对先前描述的Mark Removal/Release Fimeal inspractions/repraceement/replionements的负面选择
。两种λ-RED质粒都包含TETA可选标记。为了治愈质粒 ，将菌株与λ-RED诱导在37°C下孵育3ml lb
，将菌株镀到固体培养基上，在42°C下孵育2-4小时 ，然后在37°C下孵育
，直到可见菌落 。将菌落捡入150 µl lb中，孵育3小时 ，然后将10 µL转移到带有四环素的Lb中
，以鉴定缺乏质粒的菌落。 　　如前所述，MASC-PCR用于同时检测到多达11个TGA到TAA转换或背景突变逆转 ，如先前用TAG转换15所述
。根据Kun的寡核苷酸TM计算器，所有引物均采用61°C退火温度设计
，同时根据Benchling的Primer二级结构预测功能，避免了二级结构中的3'端结合。每种反应由KAPA 2 g快速多重饰面（KAPA生物系统 ，KK5802）
，2 µL模板DNA和0.2 µM的每个底漆的每个底漆组成 。MASC-PCR结果以2.2％的琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色运行
。λ-红色介导的重组或结合后，使用集落PCR来确认在所需位置的存在和不存在可选标记。菌落PCR（每反应为10 µL；在61°C（Kun的寡核苷酸TM计算器）下退火）使用KAPA 2G快速热门readymix遵循制造商的协议 。对用溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶分析了结果
。Sanger测序由Genewiz进行。 　　如前所述15 ，使用协议进行共轭装配基因组工程（CAGE） 。供体菌株偏离以前的方案
，除了卡纳米霉素的耐药性转移（KANR-ORIT）盒子设置〜3-5 kB上游（扩展数据2和补充表10）外，供体菌株具有两个正标记 - 一个光霉素标记和庆大霉素标记物 ，每个标记物
，每个标记物，每个标记物 ，每个标记物
，每个标记物，每个标志物（庆大霉素标记）
。供体菌株还包含一个改良的RK24质粒 ，其中将标记密码子中末尾的所有基因都重新编码为TAA10。用500 µl lb将细胞斑冲洗两次，并收集以1 ml 10-2的共轭细胞稀释
，然后在新管中额外稀释10倍 。将50 µL的10-2和10-3稀释液铺在LB琼脂板上，并使用适当的抗生素选择可选的标记和供体区域可选标记
。以96孔格式生长了47个候选菌落 ，并通过PCR（以确认存在和不存在可选标记物）和MASC-PCR（以确认存在散布的所需密码子替代品）
，以筛选出所需的基因型。对于大型基因组转移（> 1 MB），通过WGS验证了最终菌株（请参阅“基因分型 ”） 。所得的应变包含三个可选标记 ，所有标记随后通过DSDNAλRED-RED TOLC介导的选择 - 选择分别（分别通过SDS或COLE1选择）删除
，或在下一个共轭64中维持。 　　为了减少要求通过法师重新编码的基因的总数，根据Blattner Laboratory29的先前工作 ，鉴定了16个包含229个基因（后3个后3个归类为假基因的）的多基因区域（3个后期分类为假基因）（扩展数据图1）
。每个有针对性的删除位点（大小最高〜34 kb）都是通过可选标记位移和反选择来取代的
，以根据以前的协议64的规定，以进行后续标记删除。如前所述15,64 ，对固体培养基上的COLE1选择进行 。为了预选名
，将5 µL恢复的培养物与甲苯霉素（对照）或CoLE1接种到150 µl lb中，并用万古霉素（64 µg mL-1）在96韦尔板中三式单份（64 µg mL-1） ，并在34°C下以34°C孵育16小时，以监测与ProCEnitorCeNitorcenitorceNitorceNitorceNitorceNitor菌株的生长
。在甲苯霉素和COLE1中均具有万古霉素的菌株被认为是TOLC缺失阳性的
，随后将COLE1的LB琼脂平板铺在单克隆菌落选择的LB琼脂板上，并筛选了PCR以确认TOLC的损失。随后的MASC分析允许选择具有缺失事件和TGA转换的菌株 ，以减少法师周期的总数 。在每个TOLC放置和基因位移后
，分析了应变生长曲线以评估基因缺失对应变表型的影响（请参阅“适应性分析
”）
。评估了重大增长障碍。其他重大缺失（> 50 bp）是由高度重复的非编码基因，主动转座元件或从结合中疤痕的诱变而产生的 。 　　使用Qiagen Dneasy血液和组织分离试剂盒分离整个基因组
。为了在结合后进行高保真基因组分析 ，通过YALE CENTER由YALE CENTER用于基因组分析中心
，使用HISEQ 4000收集了通过简短阅读的150 bp（50倍覆盖范围）配对的光照射数据获得的原始读数。通过Pacific Biosciences单分子实时（SMRT）分析制备了长阅读（<25 kb，50倍覆盖）数据 。为了进行快速的全基因组分析 ，通过质粒牛津纳米孔标准细菌WG（30倍覆盖）通过悬浮在DNA/RNA屏蔽中的细菌颗粒提交获得了原始读数
。为了对原始读取进行分析
，最新版本的BRESEQ 0.38.1计算管道用于将序列读取到rec1.ΔA（C321.ΔA）参考基因组，使用Linux上的Ubuntu LTS运行 ，根据HTTPS：//brarricklicklab.org37。摘要.HTML输出提供了全面的不匹配
，Indels和缺少或新颖连接的列表，以监视TGA转换进度 ，删除和背景诱变 。然后通过类型在Excel中组织突变（请参阅补充表）。 　　图2B中的RF2.b3的3D结构是通过从氨基酸序列提交（补充表17）的替补Alphafold48在线预测获得的，并以空间为导向以查看主要反应位点
。 　　在一式三份的一式两份方面
，具有PRFB变异表达质粒的菌株（如扩展数据图4和补充讨论1）用卡纳霉素耐药性（KANR）dsDNA盒电穿孔，以使基因组PRFB的位移 ，以在3 h prf int prff in for 3 h prf in for 3 h prf int prff ins Genomic PRFB中恢复。然后将菌株1:50稀释到25 µg ml -1 kanamycin的选择性LB培养基中
，并在37°C下摇动，在Biotek Synergy H1读取器（Agilent）中监测600 nm的吸光度 。生长36小时后 ，据报道每种菌株的OD600在互补后为生存能力
。通过在恢复后选择性培养基上的敲除菌株并进行筛选以确认基因组PRFB的KANR位移来分离单个菌落。通过WGS（质粒）证实了用PCR筛选阳性的菌落
，以不携带基因组PRFB或次级突变，以及其含有PRFB的质粒的全质粒测序（质粒）以确认变体 。 　　我们使用了双荧光MCHERRY -YFP报告基因来测试停止密码子读取 ，如先前报道的66
。该报告基因从低拷贝主链（P15A）组成性表达
，以最大化动态范围，以检测转录后波动。每个评估的应变都用记者的四个变体（三个终止密码子和一个感官密码子阳性对照GCG）转换 ，并在选择性培养基上镀以过夜生长 。Colonies were picked in triplicate into 150 µl cultures of LB with appropriate selection in 96-well plates, grown with shaking at 225 rpm in 37 °C for 18 h after which timepoints measurements were taken for mCherry (excitation: 585 nm, emission: 635 nm, gain: 100), YFP (excitation: 500 nm, emission: 541 nm, gain: 80) andBiotek Synergy H1读取器（Agilent）中的OD600（吸光度：600 nm）
。为了评估同源琥珀色或蛋白石抑制
，将带有CUA或UCA反密码子的SUPD52的质粒与双荧光报告质粒共转化。所有应变和质粒条件的荧光值都归一化为OD600，然后除以上述阳性对照 ，以达到分数MCHERRY和YFP信号 。 　　对于所有噬菌体实验，在37°C的TK中进行生长；在37°C下孵育的固体TK底部琼脂中
，TK马虎琼脂中发生了感染和传播
。使用前，将TK草率的琼脂混合物保持在45°C。 　　为了进行繁殖 ，大肠杆菌MG1655在3 mL lb中生长到中期阶段 。将两百微晶的细菌添加到3 ml TK马虎琼脂中。紧接着
，直接从冷藏量中添加了50 µL噬菌体（10至100倍稀释液），以进入草细菌培养物中
。将三毫升的草率细菌噬菌体培养倒在固体TK底部琼脂板上 ，均匀分散
，然后在室温下固定以凝固。然后将板在37°C下孵育约16小时，以允许裂解完成 。收集整个草率的琼脂并用0.22 µm的滤光柱过滤（12,000g ，2分钟）和3 mL上清液以去除细菌
。 　　将细菌菌株在37°C下过夜
，直到OD600达到2-3。将二十微升细菌添加到3毫升马虎琼脂中 。将三毫升的草率细菌培养物倒在固体TK底琼脂板上
。在室温下孵育15分钟后，将3 µL的噬菌体稀释液（101至108倍稀释液）放在固化的马虎琼脂表面上。一旦滴干干燥 ，将板在37°C下孵育过夜 。对单个滴剂计数可见的斑块
。根据斑块的数量
，df是噬菌体稀释因子，而V是板块上吸管的噬菌体稀释剂的体积。 　　动力学生长（OD600）曲线是通过监测Biotek Synergy HT读板读取器中的应变生长而获得的 。Each strain was grown in triplicate within 96-well plates, 150 µl LB and 150 µl M9, within 96-well flat-bottom plates, incubated at 34 °C for intermediate λ-Red+ strains and 37 °C for final strains, 225 rpm, for 16–36 h and absorbance at 600 nm was read at 10-min intervals.在制备过程中 ，菌株在LB中生长至汇合，将1:15稀释到150 µL M9最小培养基中
，并接种1：100至150 µl lb和M9
。营养营养菌株显示M9没有生长。 　　使用标准曲线将BioTek Synergy HT读板读取器获得的吸光度重新校准为OD600（在600 nm至1 cm途径下的吸光度） 。MG1655的过夜LB培养物的OD600在半微米比色绿色（1 cm途径）中以1:10将培养稀释到1 ml lb后，在600 nm波长下以600 nm波长的形式测量MG1655的OD600。为了产生校准曲线 ，通过在LB培养基中稀释
，一系列OD600培养物范围为0到6
。然后，这些培养物由Biotek Synergy HT板读取器进行测量 ，其设置与生长培养物相同。然后将平均值拟合到多项式标准曲线进行重新校准 。不考虑板孔中介质蒸发的影响
。 　　重新校准的生长曲线用于计算加倍时间和最大值。使用滑动窗口Method67进行Log2 OD600的线性拟合
，其中丰富的培养基的窗口大小分别为50分钟，在早期对数阶段中 ，M9最小培养基的窗口大小分别为100分钟 。加倍时间被计算为斜率的倒数
。MaxoD在36小时内获得。个体生物样品n≥4 。 　　通过Twist Bioscience合成AAR和tRNA的基因片段
，并通过金门组装克隆到表达载体中
。通过全质粒测序（质粒或Quintarabio）验证质粒。所有克隆都是在Mach1（Thermo Fisher，C862003）中进行的 。 　　通过标准电穿孔方案用OT-Reporter质粒转化重新编码的菌株
。将电穿孔菌株在2 mL lb或SOC中回收至少2小时 ，然后用卡纳米霉素（50 µg mL -1）将电压株镀到LB琼脂板上
，并在37°C下孵育过夜。在96个深孔板中，在800 µl lb中采摘并在800 µl lb中挑选出三个单个菌落 ，并在96个深孔板上，用呼吸薄膜（Sigma-Aldrich）密封
，并在37°C下以220 rpm的速度在37°C下孵育20-24 rpm 。对于在UAG和/或UGA的NSAA合并，过夜生长后 ，将培养物1:50重新降低到底部的底部黑色96孔板（Costar）
，总共补充了150 µL含卡纳霉素（50 µg ML-1）的LB，ATC（100 ng ml-1 ng-ml-1） ，pac-arbabinose（100 ng ml-arabinose）（100 ng ml-arabinose）（0.0 ng and-arbabin off）and/arbabin off）and/arabinabin off and/arbabin off）。博克
。细胞生长（OD600的吸光度）和GFP荧光（激发485 nm
，发射525，增益70 ，底部测量）在Biotek Synergy H1板读取器（Agilent）中测量24小时
，在10分钟的间隔内进行线性摇动。使用自定义Python脚本分析数据 。所有报告的GFP荧光均在每个相应条件中归一化为ELP – 3×TAC – GFP对照荧光
。 　　rec∆a.b3的单个菌落和rec∆2.Δa.b3.tw*（OCHER）含有双OTS双重报告质质粒在2 ml Lb中接种，在250 µg ml-1 kanamycin中 ，在14 mL Falcon Tube中
，在37°C下在220 rpm处摇晃，在14 mL Falcon Tube中倒入14 mL Falcon Tube。过夜生长后 ，将培养物在25 ml lb -kanamycin中稀释1：100，并在0.6时生长至OD600
，在0.6时，培养物中培养有1 mM PACF和10 mM Bock ，并用100 ng ml -1 ATC和0.05％W/V-芳替糖诱导 。将培养物在37°C下生长过夜
，然后通过在50 mL离心管中以3200g离心20分钟收集细胞，并在-80°C下储存直至蛋白质纯化
。 　　将冷冻的大肠杆菌细胞颗粒在冰上解冻 ，并通过超声处理裂解
，裂解缓冲液由50 mM Tris-HCl（pH 7.4、23°C），500 mM NaCl ，0.5 mM EGTA
，1 mm DTT，10％Glycerol ，10％NAF
，NAF，50 mm NAF和1 mm NA3O4V。用两轮离心在4°C和14,000克进行20分钟进行阐明 。将无细胞提取物应用于Ni-NTA金属亲和力树脂 ，并根据制造商的说明进行纯化
。洗涤缓冲液含有50毫米Tris pH 7.5 、500 mm NaCl，0.5 mm EGTA
，1 mm DTT，50 mm NAF ，1 mm Na3vo4和10 mm咪唑。用含有250 mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱蛋白质 。洗脱蛋白进行4发缓冲液交换（20 mM Tris pH 8.0和100 mM NaCl）
，并使用30 kDa分子量截止型旋转过滤器（Amicon）浓缩
。 　　如前所述，对亲和力纯化 ，缓冲液交换的ELP – GFP报告基因蛋白或全细胞裂解物
，并通过质谱法消化和分析，如前所述 ，一些修饰为55,68,69。将ELP – GFP报告基蛋白（5-10μg）用水和20％SDS稀释
，最终体积为115μl，最终浓度为1％SDS 。将样品在55°C的热块中定性15分钟。使用最终的TCEP和CAM浓度分别为10 mm和44 mm ，用TCEP和2-氯乙酰氨酰胺（CAM）进行了半胱氨酸的还原和烷基化
。还原反应在55°C下进行20分钟。将6μl的50 mg ml-1 SP3珠（速度珠
，细胞珠）预洗并用水重悬于样品中，最终工作量为134μl 。通过添加150μl的100％乙醇来诱导蛋白质与珠子的结合
。将结合混合物在24°C的热电器eppendorf中在1,400 rpm中孵育10分钟。结合后 ，将珠子磁化在磁架上，并去除上清液 。随后是三轮珠洗涤
，每洗每洗80％乙醇
。上次洗涤后，所有80％乙醇的痕迹均已去除。将每个样品中的珠子重悬于50μl的消化溶液中 ，其中含有0.4μg测序级胰蛋白酶（Promega）在50 mM碳酸氢盐三甲基铵（TEAB）缓冲液（Sigma）中 。将摘要在37°C下以1,400 rpm的速度在37°C下孵育16小时
。将珠子磁化
，并将50μl上清液移至新鲜管。将珠重悬于50μl的50 mM茶库缓冲液中，并在37°C下以1,400 rpm的速度在37°C下孵育5分钟 ，以最大化肽恢复 。再次将珠子磁化
，并将两个50μl上清液组合在一起
。将肽在室温下在真空离心机中干燥。将干燥的肽用0.1％甲酸在2/98乙腈/水中重构，并通过LC -MS/MS分析 。使用VanQuish Neo UHPLC系统（Thermo）进行LC – MS/MS 和Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪（Thermo）。所采用的分析柱是内径75μm的融合二氧化硅毛细管（Molex） ，内部堆积了15 cm的长度
，使用甲醇作为包装溶剂
。用融合二氧化硅发射器（Bruker）连接到PepSep喷雾适配器上。使用在乙腈（溶剂A）中的0.1％甲酸（溶剂A）和0.1％甲酸（溶剂B）中的0.1％甲酸和0.1％甲酸的混合物实现肽分离，具有41分钟的梯度；0/5
、30/30、39/45 、40/55
、41/100（时间（min）/b（％） ，步骤之间的线性斜坡） 。用300 nl min -1的流量进行梯度
。在样品之间进行了至少一项空白注射（5μl2％B）
，以消除分析柱上的肽含量。胰蛋白酶消化的BSA和100​​ ng胰蛋白酶消化的HELA蛋白标准的一百纳米尔元素在样品之间定期运行，作为质量控制标准 。质谱仪用以下参数运行：（MS1）60,000 Orbitrap分辨率 ，250％归一化AGC目标，最大注射时间为50 ms
，300-1,400 m/z扫描范围；（数据依赖性MS2）离子陷阱检测器，200％标准化AGC目标 ，最大注射时间13 ms
，前10个模式，1.2 m/z隔离窗口 ，30％归一化HCD碰撞能量
，40 s动态排除
。Data were searched using MaxQuant version 1.6.10.43 with deamidation (NQ), oxidation (M) and phospho (STY) as variable modifications and carbamidomethyl (C) as a fixed modification with up to 3 missed cleavages, 5 amino acids minimum length and 1% false discovery rate against a modified Uniprot E. coli database containing custom MS-READ reporter proteins.使用Maxquant和Perseus版本1.6.2.2分析了MS-Read搜索结果。 　　从选择性LB琼脂板（37°C下的LB板 +抗生素24 h）中接种前培养物，并用50 µg ml -1 kanamycin在220°C下在220 rpm摇动时在37°C下过夜 。在20 mL TB中 ，将隔夜的前培养物稀释至50 µg ml -1 kanamycin中的0.1的OD600
，并生长至OD600 = 0.6-0.8
。将PACF添加到最终浓度为1 mm。用100 ng ML -1 ATC和0.05％阿拉伯糖诱导报告基因和OTS表达 。通过在4,000G处离心后8小时收集细胞，并去除上清液
。将细胞颗粒重悬于1 ml洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl ，150 mM NaCl
，pH 7.5）中，转移至1.7 ml管 ，并以17,000克离心。然后除去洗涤缓冲液，然后将细胞沉淀物存储在-80°C下
，直到进一步使用 。 　　将沉淀重悬于足够量的洗涤缓冲液中，以将OD600归一化至10。使用Sigma-Aldrich 1×Bugbuster裂解1 mL细胞（从10倍库存） ，并以16,000g离心
，以分离可溶性分数
。 　　GFP定量方法是从以前的工作中改编的70。在BL21中表达了具有N端6×His tAg的ELP – SFGFP标准（含有固定的终止密码子并克隆在PET28A载体中） 。使用Ni-NTA色谱柱纯化ELP – SFGFP标准，并使用Pierce BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher）对蛋白进行定量蛋白质
。通过将纯化的GFP标准标准标准升至由ocher制备的裂解物中产生的GFP标准曲线 ，该曲线不含GFP。GFP在28、18.6 、12.5
、8.3、5.5 、3.7、2.5
、2.5、1.6 、1.1
、0.7、0.7 、0.5和0.3 µg mL -1中以三次三级线性标准GFP曲线产生 。以类似的方式制备了不同GFP表达菌株的裂解物
，并适合标准曲线的线性范围
。在H1M Biotek读取器中测量了澄清的裂解物的荧光（激发：485 nm，发射：510 nm ，增益：60）
，以及GFP标准的标准。荧光值转化为µg mL -1，并用于计算表达蛋白的总产率 。 　　统计显着性通常是由两尾未配对的t检验产生的
。MCHERRY –YFP读取测定的P值（图2E ，F和扩展数据图5E）使用韦尔奇的未配对t检验计算了每个成对的密码子和抑制器条件中的rec∆1.ΔA。误差线显示S.E.M.
，n = 3 。噬菌体感染测定法（图3）和TrnatRP UGA抑制测定（图4C，D）的P值是通过与每个图内的大肠杆菌MG1655进行比较的
。误差线显示95％置信区间 ，n = 3。trnATRP UGA抑制测定的P值（图4C）是从未配对的t检验中得出的，与每个菌株中无MJ-tyrots质粒有关 。误差线显示95％置信区间
，n =3。应变加倍时间的P值和最大OD600使用Mann-Whitney U检验计算，将应变值与每个图内的RecΔ1.p.A的应变值进行比较
。误差线显示95％置信区间 ，n = 7或11重复（图5）
，n = 8（扩展数据图3，lb）或n = 4（扩展数据图3 ，2×2×yt和tb）重复。ELP – GFP荧光测定中评估NSAA掺入效率的P值（图6b-d和扩展数据图9C – E）来自未配对的t检验
，将数据与每个NSAA条件中的recΔ1.a进行了比较 。误差线显示95％的置信区间，n =3
。RF2互补荧光蛋白产生的P值（扩展数据图4F和补充图3A）比较了从RF2 B2（P205）互补菌株与B1（野生型）含量（野生型）含量（野生型）含量（野生型）型荧光菌株表达的GFP的荧光。（n = 3） 。错误条显示S.E.M.P值比较了各种香草酸浓度的RF2.B1和B2 TGA读数（补充图3B） ，而在每个应变释放因子变体中
，w tests计算了每个应变释放因子变体中的0 µm散酸（n = 3）（n = 3）
。错误条显示S.E.M.使用Graph Pad Prism（V.10.1.0）生成计算和图。使用Adobe Illustrator 2023（V.28.2）制备数字 。所有测量均来自不同的样本，除非随着时间的推移反复测量以收集时间课程
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。