D级真菌GPCR二聚体Ste2的激活机制

　　样本量未通过统计方法预先确定 ，没有随机分配到实验中
，研究人员并未对实验分配或结果评估视而不见 。 　　编码野生型酿酒酵母Ste2（残基1-431）的构造，其中包括烟草蚀刻病毒（TEV）切割位点 ，EGFP和Decahistidine Tag（WTSTSTE2-TEV-TEV-TEV-EGFP-HIS10）
，合成了Gene fragment（IDT）（IDT）（IDT）（IDT）（IDT）生物科学）在大肠杆菌XL10-GOLD43中的体内组装
。Ste2在Trichoplusia ni高五个细胞（Thermo Fisher Scientific;我们没有使用FlashBAC Ultra System（Oxford Expression技术）制备的高尺寸重组杆菌病毒测试中的trichoplusia ni高五个细胞（Thermo Fisher Scientific;我们没有测试分枝杆菌）的表达。然后通过离心收集细胞，在液氮中闪烁闪存 ，并存储在-80°C下直至进一步使用 。 　　拮抗剂α因素肽[DES-TRP1，ALA3
，NLE12]α因子与序列HALQLKPGQP [nle] Y由Genscript合成
。该肽的生化拮抗作用已得到很好的特征3,4,8,31。用氯丁氨环氨酸的α因子在12的位置取代蛋氨酸会导致生物学特性变化4 。以下程序用于净化拮抗剂结合的ste2，并根据我们先前描述的程序进行了调整以纯化激动剂结合的ste21。下面描述的所有纯化步骤均在4°C下进行
。Insect cell membranes from 2 litres of culture were prepared by three iterations of homogenization using an Ultra-Turrax disperser (IKA) in homogenization buffer (10 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF, 25 U ml−1 benzonase, 10 mM MgCl2, supplemented with EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets (Roche), 1 mM苯甲胺HCl ，2 µg ml -1折断蛋白
，1 µg ml -1 pepstatin，0.5 mM AEBSF ，10 µg ml -1豆l-1大豆胰蛋白酶抑制剂和10 µM leupeptin）和10 µM leupeptin）和超低剂量为125,000g
，持续90分钟。将膜重悬于溶解缓冲液中（20 mM HEPES PH 7.5 、100 mM NaCl，20％甘油 ，2 mM PMSF
，25 U ML-1苯并酶，10 mM MGCL2和10 mM MGCL2和蛋白酶抑制剂鸡尾酒） ，其中含有10 µm抗体α-替代剂peptide和2 H 。最终浓度为1％（w/v）Lauryl麦芽糖新乙醇（LMNG）（Anatrace）
，0.1％（w/v）胆固醇半核酸半核酸（CHS）（Anatrace）添加到膜悬浮液中，并孵化2 h
。进行超速离心（125,000克45分钟）以澄清样品 ，并补充了8 mM咪唑，并与10 mL Super Ni-Ni-NTA琼脂糖树脂（Generon）批量混合2小时。The resin was packed by gravity-flow and washed with four column volumes of wash buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 20% glycerol, 10 mM MgCl2, 0.02% (w/v) LMNG, 0.01% (w/v) CHS, 1 μM antagonist α-factor, 40 mM imidazole) and was eluted with elution buffer（20毫米HEPES pH 7.5
，100毫米NaCl， 20％甘油 ，10 mM MGCL2
，0.02％（w/v）LMNG，0.01％（w/v）CHS ，1μM拮抗剂α因子
，300 mM咪唑） 。将洗脱体与2.5 mg TEV蛋白酶和1 mM DTT一起孵育过夜
。将切割样品交换为脱盐缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5
、100 mM NaCl，20％甘油 ，10 mm MGCL2
，0.02％（w/v）lmng，0.01％（w/v）CHS ，使用1μmAntagisistα-型α-纤维分子
，5 mm imidazole sephadazole sephadex g-5555555555555555555555555。卫生保健） 。然后，通过对Talon树脂（Takara Bio）的负纯化去除TEV蛋白酶和裂解的EGFP-HIS11
。使用50 kDa的分子量截止氨基分析型超离心浓度（Merck）浓缩流动部分 ，并以0.35 ml min-1的加载到一个敏捷的Bio Sec-5500Å柱上，在20 mm HEPES中预校准了20 mm Hepes pH 7.5
，100 mm nacl，2 mm nacl ，2 mmmmgcl 2 gd gd gd gd and/vdn gd gd gd gd gd and/vdn/vdn。α因子 。汇总包含Ste2的峰值分数并浓缩
。通过Nanodrop 2000（Thermo Scientific）在280 nm处估算蛋白质浓度
，使用1.157 mL mg -1 cm -1的灭绝系数估算。 　　如上所述，在激动剂结合的状态下进行Ste2的纯化除外 ，除了用序列WHWLQLKPGQPMY（Genscript）替代拮抗剂α因素肽 。 　　为了在不含配体状态下纯化Ste2
，我们设计了PSGWAW，涉及添加纯化的野生型GPA1 – Ste4 – Ste4 – Ste18异三聚体以稳定无配体Ste2 ，然后再从细胞膜溶解。Since the agonist α-factor was not present, the wild-type Gpa1–Ste4–Ste18 heterotrimer transiently stabilized Ste2 during detergent solubilization, but did not form long-term stable interactions with the receptor, thereby allowing purification of ligand-free Ste2 in reasonable yields that were not achieved in the absence of wild-type G protein heterotrimer.最近使用类似的方法来纯化无配体状态的B1 CGRP受体进行冷冻结构测定
，但是在该研究中，在昆虫细胞中共表达特定的突变体Gα11蛋白 ，以瞬时稳定无配体无形CGRP受体13
。如先前所述
，进行了野生型GPA1 – Ste4 – Ste4 – Ste18杂三聚体的纯化。简而言之，表达野生型GPA1并从大肠杆菌中纯化 。使用FlashBac Ultra System（牛津表达技术）共表达Ste4 – Ste18并从T. ni细胞（表达系统）中纯化
。野生型GPA1 – STE4 – Ste18异聚合物复合物是通过以1：1摩尔比混合GPA1和Ste4 – Ste18二聚体形成的 ，并在SuperDex 200 10/300 GL柱（GE Healthcare）上加载并分离该复合物，并与10 MMMMMMMMMMMMGLY 2 MMGLY 2 MMGLY 2 MMGLER
，MMGLY 2，MMGLE（GE Healthcare）。和0.01 mm GDP 。合并峰值分数 ，并将络合物浓缩在10 K分子量截止Amicon Ultra离心集中器（Merck）中
。为了稳定不含配体的Ste2
，将带有Ste2的昆虫细胞膜与5.7 mg纯化的野生型GPA1 – Ste4 – Ste4 – Ste18杂三聚合物孵育，并补充了400 ML-ML-1 apyrase 2 h。然后 ，如上所述对拮抗剂结合的Ste2进行溶解和无配体Ste2的纯化
， 除非在整个纯化过程中未添加α因素肽 。由于在没有α因子的情况下，野生型GPA1-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-Ste4-STE18异聚合物 ，因此从Ni-NTA柱中汲取的Ste2不包含任何G蛋白异三聚体
，因为它在洗涤步骤中被消除了
。目前只能使用有关GPCR的无配体状态的有限结构信息13，此处描述的PSGWAY方法可以适应其他GPCR的无配体状态。 　　通过将3μL纯化的激动剂结合的Ste2（4.7 mg mL-1） ，拮抗剂结合的Ste2（3.1 mg ML-1）和无配体的Ste2（3 mg mL-1）应用于发光的孔（Quantifoil au 1.2/1.2/1.3 300）mesh上
，制备了冷冻EM网格 。在使用FEI Vitrobot Mark IV IV在100％相对湿度和4°C的情况下，将网格用滤纸用滤纸覆盖2.5 s
。所有冷冻EM数据集均在运行300 kV的FEI Titan Krios显微镜上收集。对于拮抗作用的Ste2数据集 ，将图像记录在量子能量滤波器（GATAN）的K3直接电子检测器上，以零能量损耗模式运行
，其狭缝宽度为20 eV，以获得100 µm物镜的样品的剂量替代电影 。以105,000×（每个像素为0.86Å； LMB Krios3）的放大倍数记录15,751个显微照片 ，为剂量分级的电影框架
，暴露时间为2.08 s，总暴露于57 e –Å-2和defocus范围为57 e –Å-2和defocus范围。对于无配体Ste2数据集 ，将图像记录在以100 µM物镜光圈为电子事件表示（EER）模式下操作的Falcon 4直接电子检测器（Thermo Fischer Scientific）
。以96,000×（每个像素为0.85Å； LMB Krios2）的放大倍率记录了9,369个显微照片
，以超分辨率模式记录，暴露时间为8.81 s ，总暴露于54 E –Å-2和defocus范围
，集合在-0.8和-2.4 µm之间。对于受动物结合的Ste2数据集，将图像记录在计数模式下的K2直接电子检测器上 ，以零能量损耗模式运行
，其狭缝宽度为20 eV，以获得带有100 µm物镜的样品的剂量型电影 。以105,000×（1.1Å/Pix; LMB Krios2）的放大倍率记录了6,944个显微照片 由于剂量分级的电影帧的暴露时间为12.5 s ，总暴露于50 e –Å2，而散热范围则设置在-0.9和-2.7 µm之间
。 　　图像堆（15,751个拮抗剂结合
，9,369个配体不含配体和6,944个激动剂结合的Ste2电影）通过将每个框架分为5×5斑块，对MotionCor244进行光束诱导的运动校正。CTF参数是从GCTF45中的非剂量加权显微照片估算的 ，具有用于拮抗剂和激动剂结合的STE2数据集的设备平均值
，以及RIGION3.146中的CTFFIND-4.1，用于配体无配体Ste2数据集 。使用warp47中实施的BoxNet深卷积神经网络进行自动打击 ，该网络分别产生4,982,771个颗粒
，2,409,127个颗粒和1,854,85​​4个颗粒，用于拮抗作用 ，配体和牵引力和激动剂 - 固定的ste22数据集
。将颗粒在相当于190Å的盒子大小中提取
，最初缩小为每个像素3.3Å。使用Relion3.1中实现的随机梯度下降算法生成了Ab Initio 3D模型 。将提取的颗粒在RIEN3.1中的C1对称中进行两轮3D分类，并选择了显示明显的跨膜特征的颗粒 ，这些粒子产生了1,285,901个颗粒
，463,024个颗粒，399、652个粒子 ，用于替代，无抗和agonagon-bound
，figagonist-bound-bound-bound and ligand-and-bongand-bongandem-and and无agonisty and agonist-y-angonistive stepy stepy stepy222
。这些粒子与所有三个数据集中的同型二聚体Ste2一致，尽管2D和3D分类 ，但仍未获得与Ste2单体一致的可靠类。将这些颗粒在相当于210Å的盒子大小中重新提取
，并在C1对称性中进行3D重建，然后进行贝叶斯抛光 ，横梁倾斜校正和每颗粒CTF的迭代回合 。然后进行洗涤剂胶束信号的减法
，并对颗粒进行3D分类而无需对齐
。对于拮抗剂结合的Ste2数据集，选择了136,877个显示高分辨率特征的颗粒并进行贝叶斯抛光 ， 使用改进的模型和C2对称性中的3D重建的每粒子CTF细化
，该模型产生的地图将完善为2.69Å的全局分辨率（傅立叶壳相关（FSC）= 0.143）。对于无配体Ste2数据集，选择了67,791个颗粒 ，这些颗粒被选择为高分辨率
，并恢复了洗涤剂胶束信号 。使用改进的模型对粒子堆栈进行贝叶斯抛光和每粒子CTF的细化。然后将粒子堆栈导出到CryoSparc v3.148中，在C2对称性中进行了不均匀的3D细化49 ，该图的图产生了一个图表，该地图完善了3.10Å的全局分辨率（FSC = 0.143）
。对于激动剂结合的Ste2数据集
，从3D分类中获得了两个不同的类别：一个类别具有64,091个颗粒的类，与拮抗剂结合和配体的Ste2相似 ，处于不活跃状态（因此称为Ste2il）（因此称为Ste2il）
，另一个具有65,284个粒子，因此与g-crotein coutrimrimer couter couter conty contect coutime coutime coutime coutime coutrime coutime coutrime cou at coutime cou。Ste2al） 。从3D分类而没有比对的其他三个类别是异质的 ，并且在进一步的3D分类后不可能分为不同的中间状态
。然而
，这些异源类别与活跃状态更相似，因为TM7表现出相对较强的面向二聚体界面的密度 ，这仅在Ste2的活性活性状态下仅在活性和G蛋白异构体中观察到。Thus, in the presence of the agonist α-factor, the majority of particles (83.9%) correspond to an active-like state or intermediate states transitioning towards the active-like state and only a minority (16.1%) of the particles correspond to a distinct inactive-like state which is consistent with α-factor binding transitioning Ste2 into an active-like state that is conducive to G protein coupling.独特的64,091个颗粒（Ste2il状态）和65,284个颗粒（Ste2al） 分别精炼
，并显示出与这些不同中间状态相对应的高分辨率特征 。洗涤剂胶束信号被恢复，这些单独的粒子堆栈受到贝叶斯抛光和每粒子CTF的细化
。然后将颗粒导出到CryoSparc v3.1中 ，在C2对称性中
，它们在C2对称中进行了不均匀的3D细化，该图在全球分辨率为3.53Å和3.46Å中 ，分别为不活跃和类似活动的激动剂 - 激动剂结合的Ste2（FSC = 0.143）。3D分类后，将C2对称性应用于最终重建
，因为在C1对称性中获得的高分辨率冷冻em映射中，两个原始人之间没有明显差异 。此外 ，C2对称性的应用将图的分辨率提高了0.2-0.3Å
，只有在两个原始物体相同的情况下才会发生这种情况
。改进的地图分辨率提高了对中间状态Ste2il -AG和Ste2AL -AG结构的局部分辨率相对较低的地区模型建设的信心。在CryoSparc v3.1中实现的3D可定性分析10使用了对上述四个最终地图有效的精制粒子堆栈 。使用5像素图扩展和10像素软边生成的宽敞掩模用于在3D变异性分析过程中捕获任何可能的运动
。对于对应于Ste2的四个不同状态之一的每个粒子堆栈（拮抗剂结合，无配体 ，无动物结合的不活跃
，激动剂结合的活性ste2），四个正交原理（3D协方差的特征向量） 已解决。在UCSF Chimera50中检查了CryoSparc v3.1中产生的体积框架数据作为体积系列 ，并作为电影捕获 。局部分辨率是在CryoSparc v3.1中确定的
，该分辨率使用了类似于BSOFT PACKANT51的Blocres程序的本地窗口FSC方法。在依赖或Cryosparc v 3.1中生成后处理的地图
。扩展数据中显示的后处理图3a – d是使用Deepemhancer算法52生成的。 　　Ste2 – Minigpa1 – Ste4 – Ste18复合物（PDB：7AD3）的Ste2受体部分的模型被用作初始模板，并将其拟合到UCSF Chimerax36中的冷冻EM密度图中 。与初始模型不同的受体的部分是在COOT53中手动重建的 ，然后在CCP-EM54和COOT中的CCP-EM54和Phenix55软件套件和手动模型构建中进行了迭代循环
。NAG和CHS的约束（单体库ID Y01）分别在Elbow56和Acedrg57中得出。在模型改进期间
，应用了C2对称约束 。综合模型验证是在Phenix和Molprobity58中进行的
。最终模型达到了良好的几何形状（扩展数据表1）。N末端残基1-4和C末端残基304–431看不到密度 。对于Ste2-ant，Ste2al-ag和Ste2il-ag状态 ，使用phenix.Resolve_cryo_EM59在未过滤的半映射上进行密度修饰，以更好地可视化某些较弱的地图区域
，以及在此目前的水分子中，以帮助Coot中的模型构建；但是 ，对原始EM映射进行了所有改进和地图验证
。 　　使用Pymol60（v2.5）
，UCSF Chimera50（v1.15）和UCSF Chimerax36生成所有数字。3D方差分析图中的蛋白质主链（扩展数据图6）在COOT中的地图框架中灵活地拟合 。使用中空V1.361计算结合口袋体积（扩展数据图5E），并使用UCSF Chimera进行可视化
。 　　使用CHARMM 36M Forcefield62和Gromacs MD包进行了全原子分子动力学模拟。模拟是从Ste2二聚体的冷冻EM结构开始的 ，Ste2-ant
，Ste2il-ag，Ste2al-ag和Ste2 – ag – G 。Ste2 -ant的结构。使用Maestro蛋白准备向导（Schrödinger版本2021-2）制备Ste2il-AG和Ste2al-AG ，包括添加缺失的重原子和所有氢
，然后进行全能量最小化
。配体中的组氨酸残基是无关的咪唑形式。将来自冷冻EM结构的CHS分子对准并用Pymol代替胆固醇 。将蛋白质 - 胆固醇复合物作为Charmm-Gui脂质双层构建器的初始输入63,64,65，并放置在9×9 NM2 POPC双层中
。将所得的蛋白质脂质复合物用沿Z轴的受体的水分子溶剂化 ，厚度为1.4 nm。用0.15 m浓度的NaCl中和制备的系统中的电荷 。首先
，使用Nosé-Hoover Thermostat66在0.2 ns中将中和系统从NVT集合中从0 K加热到310 K
。在加热过程中，在蛋白质和脂质的重原子上施加了5 kcal mol -1Å -2的约束力。在使用NPT集合进行的30 NS平衡方案中 ，限制力逐渐降低至0 kcal mol -1Å -2，每5 ns窗口为1 kcal mol -1Å -2 。使用Parrinello-Rahman Method67控制压力
，并将模拟系统耦合到一个条压力浴
。均衡方案中的最后框架被视为常规分子动力学生产运行的初始结构。使用五个随机种子分配初始速度，以开始为每个Ste2二聚体系统的五个生产分子动力学模拟运行 。每个速度的生产运行时间为400 ns
。在所有模拟中 ， 将Lincs算法应用于所有键和水角上。集成时间步骤设置为2 fs 。将1.2 nm的截止量用于非键相互作用
，并应用了粒子网埃瓦尔德方法（PME）68来处理远程Lennard-Jones的相互作用。MD轨迹每20 ps间隔存储
。每个速度的200至400 ns生产轨迹（200 ns×5 = 1,000 ns）合并为Ste2二聚体的每个构型进行分析。 　　使用脚本GET_CONTACT（https://getContacts.github.io/）进行跨膜间螺旋残基接触分析，以计算不同类型的残基接触 ，包括氢键
，范德华，范德华 ，盐桥
，盐桥和阳离子– PI接触 。每个跨膜螺旋中残基范围的定义取自先前的工作1
。每对跨膜螺旋都作为对get_contact脚本的两个选择组的输入，以计算在整个分子动力学轨迹上的动力学和每个接触的频率中形成的触点。如果接触频率大于60％ ，则认为一对残基在模拟过程中形成持续的接触 。 　　每个系统的两个单体之间的相互作用能计算为在分子动力学模拟轨迹上与gromacs能量模块的平均值
。从一个单体中
，在TM1和TM7中的残基之间计算了相互作用的能量计算，而另一个单体的TM1和TM7中的残基。相互作用的能量计算为短范围范德华相互作用能和哥伦比克相互作用能量的总和 。 　　变构通信残基网络分析使用内部软件20,69 Allosteer来识别从细胞外配体结合区域到二聚体中细胞内G蛋白偶联残基位点的变构通信的残基网络
。我们为Ste2二聚体中所有残基的扭转角度分布计算了互相分布。然后 ，我们使用图形理论来计算最短的途径，并使用最高的共同信息连接远处的残基对
，并具有高度的共同信息 。我们计算了从细胞外残基的变构通信途径，通过配体结合位点的残基到G蛋白偶联位点残基
。以前 ，我们已经表明
，预测在变构通信管道中的残基突变显示出A级GPCRS19,69,70中受体偶联与G蛋白和/或β-arrestin的变化。用于计算变构通信途径的Ste2配体结合位点中的残基列表是根据在动态过程中与配体的接触频率选择的 。所有与配体接触频率大于60％的残基均作为配体结合位点残基。同样，G蛋白结合位点残基也通过在Ste2 -AG -G模拟的接触分析来定义
。这两组之间的管道是按照它们的力量进行分类的 ，它们的等级反映了变构沟通的力量。通过每个残基的变构通信途径的数量定义为“ HubScore”
，这用于描述每个残基对变构通信强度的贡献 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
。