凋亡的棕色脂肪细胞通过细胞外肌苷增强能量消耗

　　C57BL/6J小鼠是从Charles River获得的。H.K友善地提供了ENT1-KO和ENT1-LOXLOX小鼠 。Eltzschig。Choi等人已经描述了ENT1-NULL小鼠的产生
。35。用B6; FVB-TG（ADIPOQ-CRE）1EVDR/J（Jackson Laboratory ，StockNo 。010803）饲养ENT1-氟小鼠，以获取具有纯合子loxplank的Ent1-leartes的动物
，没有CRE或Hemizygous
。A2A淘汰动物36购自杰克逊实验室（Cearper C，129-Adora2ATM1FC/J）。A2B-KO小鼠37由德国弗莱堡M. Idzko提供 。All animal experiments have been approved by the local authorities including Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW, Germany, Behörde für Gesundheit und Verbraucherschutz Hamburg, Hamburg, Germany and Institutional Animal Care and Use Committee (protocol CBSD 21-013), San Diego, CA, USA. 　　小鼠被安置在各自的动物设施中 ，每个动物设施的光周期为12小时
，并在环境室温和湿度下访问Chow或HFD（如所示）和随意的水
。 　　六周大的雄性小鼠用HFD（SSNIFF，D12492）或对照饮食（SSNIFF ，D12450B）喂12周
，每周监测体重。 　　使用Bruker Minispec LF50H分析身体成分 。 　　将动物禁食5 h和8 µl G -1体重的葡萄糖溶液（0.25 g mL -1）被注入腹膜内（i.p.）：在注射后指示的时间点之前和处于指示的时间点之前测量葡萄糖
。用Accu Check（Aviva Nano）分析仪（Roche）对尾静脉进行刺穿，并通过ACCU检查（Aviva Nano）分析仪分析血液。 　　对于小鼠的代谢表征 ，使用现象机系统（TSE Systems）在23°C下测量23°C的氧气和运动能力
，每个光周期为12小时 。在测量过程中，小鼠单笼子 ，可随意获得食物和水
。在光周期中
，在4°C下进行1-2小时的急性冷暴露，无需获得食物和水。 　　在J. Heeren的实验室（德国汉堡大学医学中心 ，汉堡大学医学中心生物化学和分子生物学系）进行了热责任实验 。在器官隔离前，将10–13周的雄性C57BL/6J小鼠在22°C下饲养在22°C或在热责任（30°C）下3或7天。 　　将八周的雄性WT小鼠（C57BL/6背景）
，A2A-KO和A2B-KO小鼠注射内氨酸（i.p.，100 µg kg-1 ，溶解在NaCl 0.9％）（NaCl 0.9％）（Sigma-Aldrich
，i4125），I4125） ，并使用23°°C在23°°C中使用了Metabolic COCASTEN（sigma-aldrich）
，氧气消耗量（i4125）
。 　　将八周的雄性WT小鼠（C57BL/6背景）注射（i.p.）（i.p.）dipyridamole（1 mg kg-kg-1）（Sigma-Aldrich，d9766）和/或CL316243（0.3 µg kg-kg-kg-1）（Tocris ，1499）载入了该车辆（TOCRIS
，1499）的车辆（nAc）（50％）或50％DM。使用代谢笼（Phenomaster，TSE系统）监测23或4°C下的氧气消耗 。 　　按照制造商的说明 ，将微型渗透泵（Alzet
，1004，目录No
。0009922）皮下植入8周大的雄性C57BL6/J小鼠中（3.5％异氟烷）。随后 ，肌苷（0.11 µL H-1的3.4 mm溶液，每天2.4 µg）（Sigma-Aldrich
，订单，I4125号）或媒介物（NACL 0.9％）永久释放28天 。在此期间 ，小鼠要么喂食对照饮食或HFD
，并监测体重
。从第22天到第27天进行间接量热测量。28天后，将小鼠安乐死并分离器官进行分析 。 　　将八周大的雄性WT小鼠（C57BL/6背景）保存在代谢笼（现象师 ，TSE系统）中
，并随意使用食物饮食和水
。所有动物在16°C下均可适应3天，然后在4°C下容纳7天。每天在肩blade骨之间皮下注射二吡啶胺（1 mg kg-1）（Sigma-Aldrich ，D9766）或每天在肩blade骨之间地下注射溶解在车辆中（PBS中的50％DMSO）或媒介物 。 　　DIO-鼠标注射实验是在冠状生物科学上进行的
。每天在HFD（sniff
，Dio Diet D12492）（JAX菌株380050）的12周后为DIO的18周大小鼠每天注射（S.C.）（S.C.）（0.9％NaCl）或1 mg kg kg-kg-1 inosine（Sigma-Aldrich，sigma-aldrich ，no。i4125）和diet diet no 。i4125）dio2 d D.在每天开始剂量开始前1天
，进行了空腹血糖浓度（6小时后）和echomri（定量核磁共振）体积测量。给药25天后，对空腹血糖浓度进行了进一步的测量 ，并在给药26天后进行了Echomri（定量核磁共振）的身体组成测量
。每周对体重和每日食物摄入量进行监测一到六次。剂量26天后，将动物安乐死
，并分离出血液 。 　　在德国汉堡，在汉堡大学医学中心汉堡大学医学中心 ，在生物化学和分子细胞生物学系进行了8周大的雄性ENT1-WT和-KO小鼠的代谢示踪研究
。通过口腔瘤将脂质乳液标记为14C-三烯烯（每公斤0.15 MBQ）和3H-DOG（每公斤0.72 MBQ）
，通过口腔瘤给小鼠施用。施用后2小时将小鼠安乐死，并解剖器官并匀浆 。随后 ，通过液体闪烁计数来测量各自的溶解器官的放射性
。 　　使用6725个半密码炸弹量表（PARR）来测量鼠粪燃料样品产生的热量。将0.02–0.04 g的粪便放在1109a半氧气炸弹（PARR）的inconel盘中 。之后
，安装了10厘米的NI-CR环，导致电线接触样品
。最后 ，炸弹被关闭
，用氧气饱和，并放入含有400毫升DD-H2O的不锈钢罐中。在为发射电路制备电气连接后 ，燃烧样品
，并测量导致温度的升高，以实现热量计算 。 　　从8周大的雄性C57/BL6J小鼠中分离出脂肪组织 ，该小鼠在23或4°C下饲养7天
。接下来，植入了微透析膜（CMA 30线性MD探针
，目录编号8010460）。将组织放在氧气饱和缓冲液中，并使用注射泵（CMA）在1 µl min -1的流量下用灌注液（M Eiasis AB ，目录NO 。P000034）灌注。2小时后
，收集了30分钟的流动
。用可调紫外线（UPLC-TUV）系统（Waters）测量透析液的肌苷浓度。 　　对于UCP1染色，在室温下1小时 ，用2.5％的正常山羊血清– PBST（磷酸盐缓冲盐水+0.1％Tween-20）将5μm石蜡包裹的蝙蝠和WAT切片封闭 。在4°C下施加过夜的一抗（UCP1
，定制; 1：250）
。用PBST洗涤3次后，对兔子（信号史增强IHC ，电池信号
，目录，8114s ，准备使用或未稀释）进行了1小时的抗体
，并根据制造商的指示使用DAB KIT（Vector Laboratories）开发1小时。在5μm石蜡包裹的蝙蝠和WAT切片上进行标准的降血石和曙红染色 。使用Evos FL彩色成像系统拍摄彩色幻灯片的图片
。使用ImageJ2软件分析并计算出山马久毒素和曙红染色组织切片中细胞大小的定量。使用Canvas 11软件调整了图片的对比度和亮度 。 　　蝙蝠和WATI在氧气测量前15分钟（Oxygraph 2k，Oroboros Instruments）进行了15分钟的指示（载体或300 nm inosine）
。将样品转移到含2 ml孵育培养基的氧气腔中（0.5 mM EGTA ，3 mM MGCL2 6H2O，60 mm K-二甲抗合酸酯
，20 mM牛磺酸，10 mm KH2PO4 ，20 mm kh2po4
，20 mm Hepes，Hepes ，110 mm crocrose和1 g l-l-l-l-l-l-l-1 bovine serum serum serum serum serum蛋白（7.11）。当达到稳态时
，记录了体内呼吸水平，然后添加底物（状态1 ，内源性；状态2
，底物，琥珀酸；状态3 ，GDP；状态4
，钠氮杂；未偶联，FCCP（线粒体核心uncopler）） 。将呼吸率标准化为湿组织重量
。 　　如前所述38,39 ，分离并分离了人类上型脂肪组织活检和小鼠的基质血管分级细胞和小鼠bat。HMAD由C. dani（尼斯索菲亚·安蒂波利斯大学）的实验室提供，并如下所述进行了区分 。HWA是从Lonza获得的
，并根据制造商的说明进行区分。如上所述41，鼠白脂肪细胞分化了
。 　　如先前所述42进行X型蝙蝠的细胞分选。简而言之 ，在包含10 mM CaCl2的PBS中消化了合并的蝙蝠
，每毫升配置（17105-041，Gibco）和每毫升胶原酶D（110888882001 ，Roche
，Roche）（45分钟，37°C）的PBS（17105-041 ，Gibco）和1.5单位 。通过100 µM细胞过滤器过滤细胞悬浮液
，并离心5分钟（600g，4°C）
。将上清液收集为脂肪细胞分数。重悬于沉淀后 ，其余细胞通过细胞过滤器（40 µm） 。使用磁柱（Miltenyi
，130-042-401），用CD11b微粒（130-049-601 ，Miltenyi； Miltenyi； 10 µL珠子）分离CD11b+细胞
。离心流过后，重悬于沉淀并加入CD31微粒（130-097-418
，Miltenyi；每107个细胞10 µL珠子）。孵育后，将CD31+细胞用磁柱（Miltenyi ，130-042-401）拉出 。为了分离RNA
，将带有细胞级分的颗粒重悬于Trizol试剂中
。 　　将蝙蝠切碎并在消化缓冲液中消化（DMEM含有0.5％BSA和1.5 mg ML -1胶原酶II（目录NO。CLS2）） 。消化后，使用100 µM尼龙网（Merc Milipore ，NY1H00010）去除所有组织碎片
。离心样品
，并将沉淀重悬于DMEM中（ +10％FBS， +1％P/s）。2小时后 ，将培养基更改为新鲜的DMEM（ +10％FBS
， +1％Pen/strep）（差分附件） 。将细胞生长至80–90％的汇合，添加50 µL的Dynabead（创造性诊断 ，WHM-S016）
，并在37°C下孵育30分钟。之后，使用胰蛋白酶分离细胞 ，并使用强磁体分离吞噬作用阳性细胞，将吞噬作用阴性细胞用作蝙蝠衍生的成纤维细胞
。 　　为了将PDGFRα+细胞与WATI分离
，使用了磁性细胞分选（MAC）。为了获得三个8周旧WT C57BL/6J小鼠的PDGFRα+细胞的最佳产量 。将组织切碎并在消化缓冲液中消化（DMEM含有0.5％BSA和1.5 mg ML -1胶原酶II）
。消化后，使用100 µM尼龙网（Merck Milipore ，NY1H00010）去除所有组织碎片。将样品离心
，并用2 mL冰冷的MAC缓冲液（0.5％BSA，2 mM EDTA ，PBS pH 7.2中的1％p/s）洗涤沉淀 。对细胞进行计数
，并将FCR阻断试剂和PDGFRα微粒（Miltenyi Biotec，130-101-502）添加到细胞悬浮液中
。孵育15分钟后 ，用MAC缓冲液洗涤细胞
，离心并重悬于MACS缓冲液中。用冰冷的Mac缓冲液冲洗液体分离柱（Miltenyi Biotec，130-042-401） ，并将细胞悬浮液应用于柱上 。用MAC缓冲液洗涤色谱柱
，并收集通过包含未标记细胞的流动
。添加MAC缓冲液后，通过将柱塞推入色谱柱来冲洗PDGFRα+细胞。 　　按照制造商的说明（https://wwwwww.inscreenex.de/fileadmin/downmin/download/pdf/pdf/pdf/data-sheet/insinstructionmanual_mumec.pdf） ，按照制造商的说明（https：//wwwwwwww.inscreenex.de/filenex.de/screenex.de/inscreenex.de/inscreenex.de/inscreenex.mmanual_mumec.pdf），根据制造商的说明培养了鼠间质内皮细胞（INSCREENEX
，CATALOGNO 。INS-CI-1004）
。 　　Cells were washed with Hank’s balanced salt solution (HBSS) (37 °C) (ThermoFisher, catalogue no. 14025-050), 300 µl of HBSS were added to each well and the cells were incubated in presence or absence of different stimuli (UV 200 mJ cm−2 (UVP, CL-1000 UV Crosslinker) for 10 min, 60 µM nutlin-3 (Cayman,10004372）持续60分钟，1 µm - （ - ） - NE（+） - 比特拉特盐一水合物（Sigma-Aldrich ，A9512）60分钟或1 µm Dipyridamole（Sigma-Aldrich
，sigma-aldrich，d9766 ，d9766）（D9766）（DIP）（浸入）60分钟。用可调的紫外线系统（Waters）（Cortecs uplc C18柱（Waters）
，Empower v.3软件）用超高的液体色谱法进行测量 。RNA分离之前，脂肪细胞16小时。 　　使用超强的液相色谱系统（征服弹性 ，热泡科科学）与高分辨率Orlosity Orlosrap质谱仪（Orbitrap Exploris 120; Thermofisher Scientific）一起执行非靶向比较代谢组学
。Thermo Scientific Xcalibur V.4.4.16.2软件用于数据采集。 　　对于样品生成
，短暂的是，要么与乙腈（1：5（v/v））立即混合新鲜上清液进行亲水相互作用分离 ，要么被热休克（67°C
，10分钟）灭活，以进行反向相分离 ，并在-20°C下进一步储存所有样品直至分析 。在LC – MS/MS分析之前，通过离心将样品过滤（0.22 µM）
，然后在4°C下存储在自动进样器中
。在四个不同的分析柱（Agilent Hilicz，Waters Acerity C18 ，Phenomenex F5
，Thermofisher Scientific Accucore C30）上连续分离提取的和过滤的样品，每个分析样品使用电喷雾阳性和负模式 ，以覆盖宽范围的亲水性和亲脂性代谢物。每个样品集都配有矩阵空白样品
，以删除背景信号和一个汇总样本作为质量控制，以监视运行内变异性 。保留汇总样品中标准偏差不到30％的分析物进行进一步的手动数据策展和分析
。在每次运行中进行内部质量校准 ，以确保准确的质量结果。MS分析使用40–1,500 m/z的扫描范围在MS1模式（60.000质量分辨率）和数据依赖性MS2扫描（30.000质量分辨率）之间交替 。通过光谱文库（m/z云
，热泡科学），含有> 3,500个真实化合物光谱 ，根据准确的质量质量与充电比（M/z）
，色谱数据和MS/MS片段化模式鉴定了代谢产物
。复合发现者V.3.2软件用于质谱数据的非靶向分析，峰值识别和集成。定性途径分析 ，热图和火山图的产生是使用Metaboanalyst v.5.0（https://www.metaboanalyst.ca）进行的 。将代谢组学数据标准化为蛋白质含量
。 　　如前所述42进行一些适应性，进行整个安装染色的组织制备和加工。简而言之
，解剖的蝙蝠被固定在4％多聚甲醛中，并切成小块（2×2×2 mm） 。经过几个PBS洗涤步骤后 ，通过与5％甘氨酸（45分钟）孵育来淬灭自动荧光。为了阻塞和透化
，将组织块与0.3％Triton X100+0.1％柠檬酸钠在PBS中的3％BSA中孵育2小时
。用PBS将组织冲洗两次。为了染色凋亡核，将组织块在黑暗中在37°C的Tunel反应混合物中孵育2小时（原位细胞死亡检测套件 ，11684795910
，Roche） 。PBS洗涤后，将核用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色15分钟（5 µg mL-1）
。为了染色中性脂质 ，将组织块与Lipidtox深红色中性脂质染色（PBS 1：300; H34477
，Thermofisher）孵育30分钟。所有步骤均通过连续摇动执行 。对于显微镜，将组织块转移到玻璃底盘（Ibidi µ-dish ，Ibidi GmbH）中
，并使用Nikona1 Ti共聚焦显微镜成像（软件NIS-Elements进化研究，Nikon ，Nikon，RRID：SCR_014329）
。 　　将分化的脂肪细胞用PBS洗涤两次
，在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，然后用PBS再次洗涤两次。然后 ，在异丙醇（O0625
，Sigma-Aldrich）中用5 mg mL-1油红O染色2小时 。之后，用自来水将细胞洗涤3次 ，然后在室温下干燥
。用于可视化扫描仪Epson完美v370照片。 　　测量脂肪细胞中的氧气消耗率
，以根据制造商的操作指令来评估使用Agilent Seahorse XFE24分析仪（Agilent Technologies）评估氧化磷酸化的 。简而言之，将2–4×104个细胞播种在24孔XF细胞培养微板岩的孔中（Agilent Technologies ，100777-004）
。细胞在生长培养基中生长
，直到到达汇合，然后分化为成熟的脂肪细胞。在成熟的脂肪细胞上进行测定 。将培养基交换为XF DMEM中等pH 7.4（Agilent Technologies ，103575-100）
，并添加以下化合物：25 mm葡萄糖（G8270，Sigma-Aldrich） ，2 mM谷氨酰胺（G9003，Sigma-Aldrich）
，Sigma-Aldrich）和2 mm sodium-sodium-sodium-sodium-sodium-pyruvate（Sodium-sodium-pyruvate）（p5280）。将细胞在该培养基中在没有CO2的37°C下孵育1小时
。使用或不使用CL-316243（10 µM）（C5976，Sigma-Aldrich）刺激进行氧气消耗率测量 ，然后是顺序添加2 µM寡霉素（复杂V抑制剂）
，1 µm FCCP和0.5 µM FCCP和0.5 µM Rotimycin（复杂的III II II II II II II II II II II II）（103015-100）。所有上述实验程序均在37°C下进行 。确定基础和未偶联的呼吸，并在PMOL min -1中表达结果 ，并标准化为细胞数
。 　　Differentiated adipocytes or adipose tissues explants were washed twice with lipolysis medium (Life Technologies, DMEM21603) supplemented with 2% w/v fatty acid–free BSA (Sigma-Aldrich, A7030) followed by incubation with lipolysis medium containing indicated substances (inosine (300 nM) (Sigma-Aldrich, I4125),- （ - ） - NE（+） - 位盐酸盐一水合物（1 µm）（Sigma-Aldrich
，A9512），1 µm二吡啶氨基（Sigma-Aldrich ，d9766）（D9766）（D9766）（DIP）在37°C下
，在37°C和5％CO2（Murine Adipocococytes and Human）或四个（人类）或四个CO2（4）。收集细胞培养基，在37°C下与游离甘油试剂（Sigma-Aldrich ，F6428）孵育5分钟
，并在540 nm处测量吸收 。用甘油标准（Sigma-Aldrich，G7793）计算甘油释放 ，并将其标准化为蛋白质含量或湿组织重量
。 　　脂肪细胞用或不含腺苷5'-单磷酸钠盐（AMP）（300 nm）（Sigma-Aldrich，A1752）
，肌苷（300 nm）（Sigma-Aldrich，I4125） ，低氧甘氨酸（300 nm）（300 nm）（300 nm）（300 nm）（300 nm）（300 nm）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（300 nm）（300 nm）（300 nm）（300 nm）（300 nm）（300 nm） -（+） - 位盐盐一水合物（1 µm）（Sigma-Aldrich
，A9512）持续15分钟。之后，将细胞快速用PBS洗涤 ，并用0.1 M HCl裂解 。随后
，按照制造商的说明，使用Direct Camp Elisa套件（Enzo ，ADI-901-066）对样品进行了分析
。使用板读取器（Perkin Elmer）在405 nm处进行光密度的测量。 　　使用裂解缓冲液（50 mM Tris
，pH 7.5 、150 mM氯化钠，1％NP-40、0.5％脱氧酸钠 ，0.1％SDS
，0.1％SDS，0.1 mM EDTA和0.1 mM EGTA）分离蛋白质 ，并补充了完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（ROCHE（ROCHE）（ROCHE），1MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM MM和10 MM 。使用布拉德福德测定法对所有样品的蛋白质量进行定量
，然后在蛋白质印迹实验之前进行浓度归一化
。按照标准程序进行蛋白质印迹（分子量重量标记：颜色预售的蛋白质标准，新英格兰Biolabs ，P7712S
，P7719S）。As primary Antibodies UCP1 (Cell Signaling, 14670S, 1:1,000; custom made, 1:1,000), ENT1 (Antibodies online, ABIN387941, 1:500) and Calnexin (EMD Millipore Corp, 208880, 1:1,000), Phospho-p38 MAPK (T180/Y182) (Cell Signaling; order no. 9211S,1：1,000），磷酸CREB（SER133）（细胞信号传导； 9198s ，1：1,000）
，磷酸ATF2（THR71）（细胞信号传导； 9221s，1：1,000） 。使用ImageSquant 4000化学发光读取器可视化蛋白质 ，并增强化学发光试剂或带有荧光标记的二抗（抗晶型抗体IgG（H+L）的Odyssey FC成像系统（LI-COR Bioscience）：dylight 800
，4×PEG Conjugate Conjugate，根据Conjugate ，Signaler's Signally as Signalers的1.10,000 ,
，1000,000,000,000,000,000,000,000，000年。对频段进行分析并使用Image Studio Lite V.5.2软件进行量化
。有关未编写的源印迹 ，请参阅补充信息。表达值将其标准化为钙粘蛋白表达 。 　　使用Innusolv RNA试剂（Analytik Jena，845-SB-2090100）分离总RNA
，并使用互补DNA合成试剂盒（NEB，Protoscript II First strand drand cDNA合成套件）进行反转录
。使用Applied Biosystems Machine（Thermofisher Scientific）使用SYBR Green Master Mix（Thermofisher Scientific ，4309155）进行定量PCR。表达水平计算为Delta CT值
，并将其标准化为管家基因HPRT/HPRT 。有关用于实时PCR的鼠和人道底漆序列的列表，请参见补充表1和2
。通过分析熔融曲线来评估引物对质量。 　　为了研究肌苷治疗对脂肪细胞mRNA表达的影响 ，将细胞与300 nm肌苷（Sigma-Aldrich
，i4125）孵育16小时，然后再分离 。为了研究分泌因子对脂肪细胞mRNA表达的影响 ，在RNA分离之前
，将细胞用各自的上清液孵育16小时
。 　　使用标准的下一代测序散装3'poly（a）-MRNA测序进行RNA-sequencing（RNA-SEQ）。 　　为了分离RNA与细胞分数或整个组织分离，使用了核素素RNA II试剂盒（Macherey＆Nagel ，740933） 。如所述43
，在cDNA合成后进行定量实时PCR
。使用2-ΔΔCT方法将相对基因表达归一化为管家36B4 mRNA。有关所使用的Taqman分析列表，请参见补充表3 。 　　用300 nm的肌苷（Sigma-Aldrich ，第I4125号订单）或1 µM Forsk（Sigma，sigma
，od。F6886号）处理细胞15分钟
。之后，将细胞用冷三型缓冲盐水洗涤两次 ，并在500 µL的4％SDC缓冲液（4％SDC（Sigma
，订购，第30970号）和100 mM Tris（Sigma ，订购号
，NO。AE15.3）pH 8.5）中收集，并在95°C煮沸5分钟 。 　　使用Easyphos Workflow44富含磷酸肽44 ，其中1 mg蛋白质输入
。对于MS分析
，将肽在60°C的50厘米柱上加载，内径为75 µm ，内部装有1.9 µm C18 reprosil颗粒（Maisch Gmbh博士）。使用由0.1％甲酸（缓冲液A）和0.1％甲酸（缓冲液B）组成的二元缓冲液系统反向相反的相色谱分离肽在120分钟的梯度上分离 。质谱是在热轨道epploris 480质谱仪上获取的
。使用数据依赖性1 S周期时间方法进行采集
，最大注射时间为80 ms，扫描范围为300–1,650 ，AGC目标为300％，没有场不对称离子迁移率。测序是通过较高的能量碰撞解离片段进行的
，目标值为1×105，窗口为1.4 。以60,000的分辨率获得了调查扫描
。高碰撞解离光谱的分辨率设置为15,000 ，最大离子注射时间为50 ms。动态排除设置为40 s
，并启用了Apex触发器 。使用Maxquant v.2.0.1.0处理原始质谱数据，并启用了“匹配之间的匹配”
。'最大限度。错过的裂解设置为2 。如果没有否则 ，则使用默认设置。使用Perseus软件v.1.6.13.0进行了统计分析和缺失值的插补
。在PRIDE PXD032153上获得了多重性（检测到的肽的磷酸化数量）。 　　将细胞洗涤并在37°C下与HBSS孵育（Thermofisher
，14025-050） 。随后，每孔加入1 µCI 3H-肌苷（Hartmann Analytic ，ART0738）
，并将细胞孵育5分钟
。使用贝克曼计数器计数上清液中的3H。用PBS洗涤细胞，并用Triton X稀释液（VWR ，28817.295; 1：1000在HBSS中）和裂解液的3H洗涤 。将数据标准化为各个井的蛋白质浓度
。 　　使用CRISPR – CAS9系统将SLC29A1在人脂肪细胞中被淘汰。The CRISPR guide RNAs (gRNAs) were purchased from GenScript (SC1805, Species: human: 1. SLC29A1 CRISPR guide RNA 1, gRNA target sequence: GCAGGATCCCCCAGTCCGTA; 2. SLC29A1 CRISPR gRNA 2, gRNA target sequence: CAGGCTGCCCAGGATCCGTA; 3. SLC29A1 CRISPR guide RNA 3, gRNA目标序列：GCAGTATTTCACAAACCGCC）以多个v2质粒格式进行 。SLC29A1 CRISPR指南RNA 3被选择用于人脂肪细胞的实验
。慢病毒颗粒是由波恩大学药理学与毒理学研究所的慢病毒矢量平台遵循的标准程序45。一种非靶向构建体（GRNA：GCATAACGGCCGAGCACCAC）用于生产对照病毒 。播种后8小时
，用慢病毒颗粒转导人脂肪细胞，然后按照上述方案分化细胞
。 　　从genescript订购了带有wt或rs45573936变体的插入物的质粒（目标矢量名称pcDNA3.1（ - ））。播种后16小时 ，用相应的质粒转染HEK293T细胞（ATCC，CRL-3216）（标准磷酸钙转染方法） 。转染后2天进行实验。 　　对ILE216THR BMI关联（RS45573936）的BMI关联的队列分析
，这些变体是从以前描述的德国独立的Sorbs群体得出的29
。 　　该研究已获得莱比锡大学伦理委员会（Reg。088-2005号）的批准，并符合赫尔辛基宣言 。所有参与者在参加研究之前就征得了书面知情同意书
。 　　根据制造商的协议 ，使用LightCycler480系统（Roche Diagnostics）进行了ILE216THR（RS45573936）变体的基因分型。首先
，PCR在95°C下进行初始变性6分钟，然后在95°C下为20 s变性的45个循环 ，在62°C下进行40 s退火
，在72°C下启动延伸90 s，然后在72°C下最终延伸7分钟 。使用TAQ PCR核心试剂盒1000单位（QIAGEN）和0.1 mM前进和0.1 mm反向引物进行PCR ，总体积为20 µL
。对于RS4553936
，使用0.2 mm反向引物进行变体不对称PCR。通过Tib molbiol合成引物和探针 。通过使用以下方案熔化曲线分析，将产生的PCR产物用50 nm（最终）的探针低聚物（最终）进行基因分型：95°C 60 s ，40°C 60 s
，连续增加到70°C，坡道速率为0.19°C S -1
。该变体的呼叫率为99％。为了控制质量 ，所有样品中有1.8％均在对研究者视而不见的重复项中进行了基因分型 。一致性率为99％
。 　　人类队列包括来自莱比锡肥胖生物库的2,044个人的脂肪组织。从分类为正常体重的1,581个个体（n = 58，平均年龄60.5±14.8岁
，平均BMI 22.5±1.9 kg m -2），超重（n = 56 ，平均年龄65.0±12.7
，平均BMI 27.2±MM -2）或off mmi 22.4 kg m -2），从1,581个个体（n = 58 ，平均年龄为60.5±14.8岁）收集肿瘤内脏脂肪组织样本（n = 58
，平均年龄60.5±14.8岁），超重47.1±11 。7年 ，平均BMI 48.8±8.4 kg M -2）。Abdominal subcutaneous adipose tissue samples with normal weight (n = 47, mean age 64.5 ± 13 years, mean BMI 22.9 ± 1.7 kg m−2), overweight (n = 56, mean age 62.7 ± 13.5 years, mean BMI 27.3 ± 1.5 kg m−2) or obesity (n = 1,372, mean age 47.1 ± 12 years, mean BMI从1,475个个体获得48.8±8.6 kg m -2）
。其中
，配对的皮下和内脏数据来自1,013例患者。如所述的46，在选举腹腔镜腹部手术期间收集脂肪组织样品 ，立即在液氮中冷冻并储存在-80°C下 。这项研究是与赫尔辛基宣言同意的
，并获得了莱比锡大学伦理委员会的批准（批准编号159-12-21052012）
。所有参与者在参加研究之前就征得了书面知情同意书。如先前所述47测量了身体成分和代谢参数 。 　　单端和核糖体RNA缺失的RNA-Seq数据是根据SmartSeq协议48,49制备的
。简而言之，RNA富集并由Oligo（DT）和TSO底漆进行反转录。在计算机中 ，PCR引物用于cDNA扩增，并使用NexTERA DNA柔性试剂盒用TN5处理cDNA 。所有库均在功能基因组中心的Novaseq 6000仪器上进行测序
。使用FASTP（v.0.20.0
，参考文献50）计算了原始读取的适配器和质量修剪，考虑到最小读取长度为18 nts ，质量截止的质量为20。读取的读数是针对人类基因组（GRCH38.P13）的映射
，使用Star算法（V.2.7.4A，参考文献51） ，允许使用50多个Align 。应用了featurecounts（v.2.0.1
，参考52）将基因组特征分配给映射读取，并计数多个映射的读取
。使用deseq2的方差稳定转换（v.1.32.0 ，参考文献53）
，计数数据相对于库大小进行了均匀的归一化。由于数据的读取深度和性别代表了最大的方差来源，因此进行了调整以说明这一批次 。 　　为了确定足够的统计功率所需的组尺寸 ，使用初步数据使用PS功率和样本量计算软件进行了功率分析
，并且所有实验均被设计为最低0.8的实验。 　　将小鼠随机分配为实验组
。由于细胞培养实验的性质，样品的随机化不适用。由于大多数研究是由了解研究设计的个别研究人员进行的 ，因此未进行数据收集和分析期间的盲目性 。 　　两尾t检验用于单个比较和方差分析（ANOVA）与Tukey的事后测试进行多次比较
。低于0.05的P值被认为是显着的。使用GraphPad Prism v.6软件进行统计分析和数据绘图 。除非另有说明，否则N定义了分析的动物或细胞培养物的数量
。数据表示为平均值±S.E.M.的单个数据点或点图。请参阅图形
，以获取样本量和执行统计测试的描述 。 　　使用复合发现者（V.3.2，Thermofisher）执行代谢组学数据的统计评估
。假设检验是通过Tukey的事后检验的单向ANOVA模型进行的。P值由Benjamini – Hochberg算法调节 。 　　基于Spearman相关系数和0.95的置信区间 ，使用R包GPUBR（v.0.4.0）54计算了人类队列内脏和皮下WAT的基因表达之间的相关性
。使用HOLM方法校正P值以进行多重推理。根据R v.4.1进行分析 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。