AKT和EZH2抑制剂通过劫持涉及的机制杀死TNBC

　　为了测量细胞增殖和细胞毒性
，进行了手动细胞计数实验
。在第-6天，将细胞在10 cm的菜肴中以40％汇合的播种。在第-5天 ，用DMSO或TazeMetostat处理细胞 。在第-3天
，将细胞传递1：2，并保持在Tazemetostat或DMSO中
。在第-1天 ，将细胞以每孔250,000个细胞接种到六孔组织培养皿中
，以进行计数（足以用于第0天，第4天计数） ，每6厘米菜肴中有625,000个细胞以收集蛋白质裂解物。对于包括siRNA在内的细胞计数测定
，将细胞在第-1天转染，并在播种前与siRNA孵育6-8小时 。在第0天 ，使用血细胞计测量启动细胞计数
，其余细胞用DMSO，ipatasertib ，tazemetostat或组合对其进行了剂量
。在第1天，收集蛋白质裂解物。在第4天
，使用血细胞计数计对剩余的细胞进行计数 。通过标准化第4天的细胞计数值到第0天的单元计数值，计算了log2转换的倍数变化
。在-6至-1天 ，将细胞培养在含有10％FBS的适当培养基中。在第0至4天
，将细胞培养在包含2％FBS的适当培养基中 。所有实验至少完成了三次
。统计方法不用于预先确定样本量。没有进行盲目 。将细胞从主溶液中播种，并在所有比较条件下分配给播种和种群差异。 　　使用incucyte活细胞成像完成了活细胞成像
。在用TazeMetostat或DMSO预处理5天后 ，将细胞在96孔板中以每孔5,000个细胞接种。然后
，在播种后24小时，将细胞用TazeMetostat和/或ipatasertib处理在含有Nuclight Rapid Red Reagent（Sartorius ，4717）的培养基中
，以将细胞核和细胞毒素绿色（Sartorius，4633）标记为标记细胞毒性细胞 。将板放置在incucyte机器内 ，并每2小时获取每2小时获取图像
。通过量化Nuclight和Sytotox-Green阳性细胞的重叠除以Nuclight阳性细胞的总数
，使用核能和细胞毒素阳性细胞的重叠来确定细胞毒性细胞的百分比。每孔拍摄四张图像，并重复地播种每个条件 。所有实验至少完成了三次
。 　　为了测量EZH2抑制剂tazemetostat与PI3K-AKT途径抑制剂之间的协同相互作用 ，将细胞以每孔为5,000个细胞在96孔白色平板底板中播种。对于每种情况，每个组合处理都播种了两个技术重复 。用EZH2抑制剂预处理5天后
，将细胞用PI3K -AKT途径抑制剂给予
。在以下浓度下添加药物：EZH2抑制剂tazemetostat（0
、1.25、2.5 、5
、10μM）和Akt抑制剂ipatasertib（0、0.625 、1.25
、2.5、5 、5
、10μM）。治疗96小时后，使用CellTiter-GLO（Promega ，G9291）对细胞活力进行了量化
，并将其标准化为DMSO以计算抑制反应 。然后使用SynergyFinder使用Gaddum的非相互作用模型（最高的单个代理（HSA）模型）来计算协同得分，其中大于10表示协同相互作用56
。 　　所有鼠标工作都是根据Brigham和妇女医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）进行的。在肿瘤的一维中 ，最大肿瘤大小为20 mm 。SUM149PT和MDA-MB-468异种移植物是通过使用DMEM/F12和Matrigel（Cornning
，356231）的1：1比例注入3×106细胞来产生的，将其产生。对于类器官同种异体移植 ，从TRP53FL/FL小鼠产生了类器官
，并如前所述培养23,24，将50,000个细胞植入裸鼠的第四个腹股沟乳腺脂肪垫中
。对于SUM149PT和MDA-MB-468异种移植研究 ，每只小鼠植入了两个肿瘤。对于类器官同种异体移植
，MDA-MB-468异种移植生存研究和PDXS，每只小鼠植入一个肿瘤 。将HCI-025和HCI-004的肿瘤片段植入NSG小鼠中
。肿瘤在2周后出现 ，并在达到100–250 mm3时入学。使用具有公式的游标卡住（宽度×宽度×长度×0.52）测量肿瘤体积 。对于治疗时间表，在用车辆（ipatasertib车辆 + tazemetostat车辆）
，ipatasertib（ipatasertib + tazemetostat车辆），tazemetostat（ipatasertib weller + tazemetostat）或组合 + ipatemetostat（tazemetostat）（tazemetostat）（tazemetostat）（tazemetostotat）（tazemetostat）（tazemetostotat）（tazemetostat）（tazemetostat + ipateStats） ，将小鼠预处理了7天7天
，然后使用车辆（ipatasertib + Tazemetostat车辆）进行治疗
。ipatasertib每天通过口服剂量以每公斤50毫克的剂量服用。在0.5％的甲基纤维素，粘度4,000 CP中制备ipatasertib ，在pH 7.0时为2％Tween-80
，并保持在4°C时，最多可保持1周 。通过口服饲料 ，tazemetostat每天两次以每公斤250毫克的剂量服用
。在含0.1％Tween-80的0.5％甲基纤维素中制备TazeMetostat
，并在4°C保持长达4周。如前所述25,57，准备并通过PDXS HCI-025和HCI-004 。样本量已预先确定：我们计算出 ，如果我们每个治疗组使用10只小鼠
，我们将拥有87％的功率来检测50％的肿瘤大小降低， 并尽一切努力达到样本量
。动物被随机进入治疗臂。没有进行盲目 。房间内饲养小鼠的温度稳定在68至75°C之间。房间的湿度范围保持在35-65％的稳定状态 ，湿度被认为是最佳的50％
。动物在白天经历了12小时的光线，夜间有12小时的黑暗
，其光强度在100–250 Lux之间。用PICO 5052辐照的啮齿动物食物或Pico 5058辐照的小鼠小鼠食物，向小鼠提供了饮食中的饮食AB次饮食 。随意提供鼠标
。小鼠被安置在Allentown通风笼中 ，用α-搅拌或皱纹纸（仅收到基于纸质的床上用品）
，深层床上用品约1/2英寸。为小鼠提供了以巢或冰棍棒的形式浓缩的小鼠（仅提供裸鼠小鼠） 。原动物数据在补充数据2中提供
。 　　细胞系直接从ATCC购买或使用STR分析（LABCORP）进行身份验证。SUM149PT和SUM159PT细胞在DMEM/F12（Gibco，11330-057） ，293T
，RPE1，MDA-MB-157 ，MDA-MB-231
，MDA-MB-231，MDA-MB-436和MDA-MB-436和MDA-MB-468细胞中培养在DMEM（Corcornning ，core）
，coremem（Core），10--CV ，和BT1011111111，和BT）
，和MDA-MB-157，MDA-MB-157 ，MDA-MB-157
，和MDA-MB-157，MDA-MB-157（MDA-MB-157）中培养 。DU4457 ，HCC38
，HCC70，HCC1143 ，HCC1187
，HCC1395，HCC1806 ，HCC1937和HCC2157细胞在RPMI（Corning
，10-040-CV），IMR90和BJ IMR90和BJ纤维细胞系中培养在RPMI（Corning ，10-040-CV）中，并培养了BJ纤维细胞线
。所有培养基均补充10％FBS和1倍浓度的青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（Gibco
，10378016）。如先前报道的23,24，生成并培养了TP53 - / - 类器官 。如先前报道的58 ，对MCF10A细胞进行了培养
。在这项研究中未使用普遍误识的细胞系。通常发现使用Lonza mycoalert加上支原体检测试剂盒
，通常发现细胞系没有支原体污染 。 　　将细胞以每孔50,000个细胞接种到12孔板中，然后在指定的时间用晶体紫色染色。简而言之 ，除去培养基后
，用PBS洗涤井三遍，然后用2％甲醛（甲醛稀释1：2稀释甲醛溶液； SF94-4）15分钟 ，室温为15分钟
。固定后
，用PBS洗涤一次，然后用0.025％的晶体紫（Sigma-Aldrich ，C6158）染色2小时。染色后
，在使用标准扫描仪进行空气干燥和成像之前，用水洗涤四次 。 　　通过去除肿瘤并固定在甲醛新鲜剂（Thermo Fisher Scientific ，SF94-4）中，收集肿瘤4小时后4小时收集肿瘤进行免疫组织化学
。24小时后
，在切片和分析之前将肿瘤储存在70％的乙醇中。对于血久毒素和曙红染色，在哈佛医学院啮齿动物组织病理学核心进行切片和染色 。对于KI-67和EZH2（BD BIO ，612667）
，在Brigham＆妇女医院病理学核心进行了分区和染色的免疫组织化学
。 　　Chells在平均抗生素中以0.1 µm-SRNACONSTRUCTAND的1：400抑制脂肪切除型脂肪杆菌rnaimax试剂脂肪切除术（Invitrogen，1378075）的Chells进行了6-8小时。targetplus插入了Wrekey Wrezon Biozon Biozon：对照（D-01810-10-10–50） ，GATA3（L-0381-00-00-00-0005）
，JAK1，JAK1（L-04393-000010） ，BMF（L-04393-000010）
，BMF（LA-000105）BMF（LA-000105）BMF，BMF ，BMF
，BMF，L-000 3（L-0003） IL-6R（007994-0005） ，BACH2（L-00987–00），HSF1（L-012109-02）
，MEF2D（L-009884-000）NF200）NF200） ZNF143（L-01365–00），ZnF354C ，ZNF354C（L-0199-02）
，BACH1（L-00700000000）），ELFCH1（L-070000000000）（L-070000000000）（L-0700000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000来（L-01680–0000） ，FOS（L-0365–00）
，FOXO1（0306–0005），FOXO3（0307–000-000-005） ，HOXC11（L-0,002000005）
，HOXC11（HOXC11），HOXC11（L-017602-005） ，HOX11105）
，HOXD11 。（L-013095-000-0005），HOXD12（L-013096-02-0005） ，JUN（L-0368-00），MAFK（L-08580-00,00）
，SI2，SI2（L-01024-000） ，EV1（L-01024-000）
，EV1（L-01024-0001，EV1 ，EV1（L-01024-0001
，11） EV1
。 MAFF（L-003903-00），MAFG（L-009109-00） ，MAFK（L-088080-00）
，MITF（L-08674-00），MXI1（L-09947-000）（L-09947-000） ，PBX3
，PBX3（L-020121-00）（L-020121-00）（L-020121-00）（L-02133333133131313113-L-l-0213-11，L-0213-11 ，L-021，L-00）
，第61页（L-0213-LL-00） SREBF2 (L-009549-00), TBX1 (L-012195–00), USF1 (L-03617–000), USF2 (L-003617-00) SRNA contents in the pLKO.1 non-target agAT3 and GATA3 and GATA3 (TRCN000019299) widerchased wrests Sigma-Aldric. SGRNA结构在圆中v2矢量表达控制，sting和gata3 gata3 wreets中。 　　对于除协同测定外的所有测定法 ，使用5μM（S7128
，SelleckChem）使用TazeMetosat，使用5μM（S2808 ，SelleckChem）使用IPATASERTIB
，使用BYL719，使用5μm（S2814 ，SelleckChem
，SelleckChem），GDC0077（selleckchem） ，使用了5μm（S SelleckChem）（selleckchem）（seleckchem）（selleckchem）（seleckchem）（selceckchem）
，s seleck s s s s s s s s syceck（s2814）（syceck s st 5 mm）（s8668668，s866866866;GDC0941在3μM（S1065 ，Selleckchem）中使用，Mak683使用为5μm（S8983
，Selleckchem），使用Itacitinib（Jak1i） ，在500 nm（S7812
，sareckchem，sareckchem）中使用 。TBK1抑制剂GSK8612以16μM（S8872 ，SelleckChem）使用
。抗IL-6R抗体是tocilizumab
，以50μgml-1（A2012-5mg，SelleckChem）补充。以50μm（CT-Adus100 ，Chemietek）补充了STING激动剂ADU-S100（MIW815） 。多西他赛在2 nm或10 nm（S1148-10mm/1ml
，SelleckChem）中补充。 　　根据制造商的说明，使用ELISA检测到人IL-6（Thermo Fisher Scientific ，KHC0061）和2'3'-cgamp（Cayman Chemical
，501700）
。添加Akti和/或TBK1I后24小时收集IL-6（条件培养基）或2'3'-CGAMP（蛋白质裂解物）的样品。值代表将标准化为DMSO样品标准化的三个或四个生物学重复的平均值 。 　　GATA3 ORF购自PDONR221 Vector59中的Addgene（质粒81902），并使用LR克隆酶II（11791020; Thermo Fisher Scientific）克隆到Phage-Puro表达载体（Addgene质粒118692）中 ，根据制造商的规定
。通过慢病毒转导和尿霉素的选择（1μgml -1）在SUM159PT细胞中执行GATA3过表达72小时。 　　24小时后，单剂或联合处理后收集蛋白质 。Cells were washed with PBS (806544-500ML, Sigma-Aldrich) and then boiling 1% SDS lysis buffer (1% SDS (15553-035, Invitrogen), 10 mM Tris-HCl pH 7.5 (77-86-1, Sigma-Aldrich), 100 mM NaCl (S5586, Sigma-Aldrich)) was directly added to plates.刮擦板
，并使用20 g针5-6次剪切蛋白质裂解物
。将蛋白质在95°C煮沸10分钟，并以最大速度离心3分钟。使用BCA定量方法（23222 ，Bio-Rad）确定蛋白质浓度 。蛋白质在SDS-PAGE凝胶（4561084
，Bio-Rad）中运行，并转移至Immobilon PVDF膜（IPVH00010 ，Sigma-Aldrich）
。将膜用TBST中的5％牛奶封闭1小时
，然后再与一抗初级抗体孵育过夜。将膜与与原代抗体物种相对应的HRP偶联的二抗孵育 。使用放射自显影膜或Biorad Chemidoc测量HRP信号
。Antibodies for western blotting were as follows: H3K27me3 (9733S, Cell Signaling Technologies, 1:1,000), H3 (4499S, Cell Signaling Technologies, 1:1,000), PRAS40 (2610S, Cell Signaling Technologies, 1:1,000), pPRAS40 (2997S, Cell Signaling Technologies, 1:1,000), GAPDH（2118S，细胞信号技术 ，1：1,000）
，GATA3（558686，BD Biosciences ，1：250）
，1：250），PSTAT3（SC-8059 ，Santa Cruz，1：500）
，STAT3（STAT3），STAT3（9139）（9139（9139（SC-528 ，Santa Cruz
，1：1,000），FOXO1（9454 ，细胞信号技术
，1：1,000），1：1,000） ，FOXO1-PS265（9461
，细胞信号技术，1：500） ，1：500）
，TBK1（3504S，细胞信号技术 ，1：1,000），1：1,000）
，TBK1-PS1-PS1-PS1111172（543），543（543）1：1,000） ，sting（13647s
，细胞信号技术，1：1,000） ，反兔子次级（111-035-144
，杰克逊免疫学，1：5,000） ，抗小鼠中学（115-035-166）。补充数据1中提供了所有免疫印迹的图像 。 　　用指示的药物处理细胞
，然后在处理8小时后通过用PBS洗涤和刮擦来收集细胞。使用EBC裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0 ，150 mM NaCl
，0.5％NP-40，1：10,000β近甲醇 ，0.5 mM EDTA）裂解细胞，并补充了蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich
，Sigma-Aldrich，118361533001）和phoscase（Sigma-Aldrich4906837001）
。将细胞裂解物在冰上孵育20分钟 ，然后通过16,000克离心20分钟清除。使用BCA试剂对蛋白质提取物进行定量
，然后将相等的量与刺激（细胞信号传导，13647s）或IgG（细胞信号传导 ，2729s）抗体和磁性蛋白A/G珠（Pierce）孵育
，并在4°C下末端搅拌过夜 。在使用SDS样品缓冲液洗脱免疫沉淀的蛋白之前，用EBC裂解缓冲液洗涤珠五次 ，并通过Western印迹分析（如上所述）
。 　　使用Rneasy Plus套件（74134
，Qiagen）在处理8或24小时后分离RNA。使用Illumina Nextq 500 System，在Dana-Farber癌症研究所分子生物学核心设施（SUM149PT ，MDA-MB-468）或Novogene（MDA-MB-468 Docetaxel实验
，HCC38，HCC1395 ，HCC1937）中对RNA进行了测序 。将原始数据映射到HG19（SUM149PT，MDA-MB-468）或HG38（MDA-MB-468 DOCETAXEL实验
，HCC38，HCC1395 ，HCC1937
，HCC1937，HCC1937）基因组 ，使用Star和计数文件使用HTSEQ60,60,60,60
。DESEQ2用于标准化计数（平均比率法）
，计算总读数并确定差异表达的基因62。使用增强的Volcano生成火山地块，并使用PheatMap63,64生成热图 。DESEQ2用于确定从CCLE数据库收集的公共RNA-Seq原始计数差异表达的基因
。使用R中的GGPLOT2软件包生成火山图 ，并使用R中的复杂HeatMap软件包生成热图。 　　使用Illumina Novaseq 6000系统对ATAC – SEQ数据进行了测序 。使用Encode Pipeline（https://www.encodeproject.org/atac-seq/）
，读取原始测序fastQ数据并与HG38参考基因组进行对齐
。MacS2用于识别指示开放染色质区域的峰。We filtered out non-reproducible peaks by selecting peaks that were detected in replicates of each condition for each cell line, then peaks were merged for overlapping region across all conditions and samples using the GenomicRanges package in R. The consensus peaks were annotated using ChIPseeker package in R. Using featureCounts in Rsubread package in R, we counted all reads over the consensus peak regions, then performed differential accessible使用DESEQ2进行峰分析 。使用RGT HINT进行序列发现和分析。用Jaspar基序鉴定了转录因子结合位点
。基于转录因子足迹谱估计转录因子活性评分。我们根据启动子的染色质可及性差异对基因进行了排名 。如果将多个峰注释到单个基因，我们通过采取最大/最小对数转换的倍数变化来估计主要变化 <80% of peaks are more open/closed. The ranked genes were used for GSEA using the fgsea package in R. Gene sets were collected from the entire MSigDB using the msigdbr package in R. 　　For the initial training set, TPMs of RNA-seq data for 17 cell lines (10 sensitive, 7 resistant) were collected from the CCLE dataset and standardized using z-score normalization. Feature selection is important for machine learning training as too many irrelevant features can interrupt model training (for example, overfitting). We therefore selected subset of genes by ranking them in terms of its variance or log-transformed fold change. First, we selected genes that were differently expressed between sensitive and resistant cell lines with FDR <0.05. We then ranked the genes based on their variance and selected the top 50, 100 and 200 highly variable genes (represented as top 50, top 100, and top 200, respectively). We also selected genes based on a cut-offs for the log-transformed fold change in sensitive versus resistant of 2 and 5, that is, |LFC| > 2 and |LFC| >5
。在具有基因子集的训练集上 ，使用两种不同的算法RF和SVM对模型进行了训练
，然后根据其精度进行评估。我们使用剩余的交叉验证验证了模型 。在验证期间，数据集分为N子集 ，其中n是单元线的总数
。每个子集通过将一个单元线作为验证集来删除N -1个单元线。对于每个子集，我们进行了差异表达分析
，对差异表达的基因进行了差异表达分析，根据其等级 ，训练有素的机器学习模型定义了基因子集
，然后使用在整个过程中没有使用的验证单元线测试了模型 。通过每次删除一条单元线来重复n次
。当我们使用两种算法（RF，SVM）和五个基因集（前50个 ，前100名
，前200，| LFC |> 2和| LFC |> 5）时 ，我们总共有2×5×N模型。交叉验证精度由正确预测未使用的单元线/n的数量计算 。在验证和测试精度的基础上
，我们选择了最佳模型（RF，| LFC |> 5） ，然后使用17个单元线对模型进行了重新训练
。我们使用最终模型来预测TCGA数据库中TNBC肿瘤的灵敏度。同样
，获得RNA-Seq数据的TPM，然后使用Z评分归一化缩放 。使用Python的Scikit-Learn库实施了所有机器学习方法 ，包括培训，验证和测试
，包括培训，验证和测试 ，包括差异表达式和等级基因。 　　为了测量TP53 - / - 类器官同种异体移植肿瘤中的拷贝数改变
，我们通过Dana-Farber Cancer Institute Molecular Biologuly Core核心设备完成了超低通的全基因组测序
。从未处理的含有肿瘤的小鼠中分离出基因组DNA，分散和测序。分析了大约500万个图书馆的读取 ，以分辨率为100 kb的拷贝性变化 。我们使用CNVKIT管道来处理生殖线测序原始数据
。使用Python中的CNVKit库生成散点图。 　　使用GenePattern（https://www.genepattern.org/)65,66进行SSGSEA 。GSEA是使用在线可用软件（http://www.gsea-msigdb.org/)65,67进行的
。基因组发表在标志性凋亡的MSIGDB上（M5902
，Hallmark_apoptosis）68，乳腺干细胞（M2573 ，LIM_MAMMARY_STEM_CELL_UP）26和成熟的发光乳细胞（M2578：Lim_Mammary_lumalilalial_matial_mature_mature_mature_mature_mature_mature_mup）26。乳腺相关基因集源自先前的一项研究
，该研究鉴定出依赖于乳腺37中JAK1表达的相互作用中上调的基因 。 　　使用TNBCTYPE工具27,69对样品进行样品的分子亚型
。报告了每种细胞系的相关系数与最显着改变的亚型的相关系数。 　　图6i中显示的模型是使用Biorender（许可证号IY273VQW9J）创建的 。 　　将MDA-MB-468细胞以1.2×106在15 cm的板中铺板，并处理与细胞计数和免疫印迹相同
。24小时的媒介物 ，单药或组合处理后
，将细胞收集在天然培养基中。首先在室温下与2 mM DSG（20593，Pierce）交联45分钟 ，然后在37°C下1％甲醛持续10分钟，然后用0.125 m甘氨酸淬灭5分钟 。首先与缓冲液1（50 mm Hepes-KoH pH 7.5（15630-080
，Thermo Fisher Scientific），140 mM NaCl（S5586 ，Sigma-Aldrich）
，1 mm EDTA pH 8（15575-038，Invitrogen） ，SIG Cerol-cerol（10％G55516）
，通过首先与缓冲液（50 mM HEPES-KOH pH 7.5（15630-080，Thermo Fisher Scientific）孵育 ，隔离染色质。0.0033％NP-40（493015
，Calbiochem）和0.25％Triton X-100（T8787，Sigma-Aldrich）） ，然后在缓冲区2（10 mm Tris-Hcl PH 8（15567-025
，Invitrogen），Invitrogen ，Invitrogen），200 mm nacl
，1MM ph，1MM MM EDTA中恢复颗粒（10 mm Tris-HCl pH 8（10 mm）最后 ，用缓冲液3（10 mm Tris-HCl pH 8
，100 mm NaCl，1 mm EDTA pH 8 ，0.5 mm EGTA pH 8
，0.1％脱氧钙酸钠（D6750，Sigma-Aldrich）和0.5％N-氯龙sarcosine（L744141414141414141414 ，SIGMA-AR）
。然后将隔离的染色质超声处理30 s的30秒钟
，使用“高
”上的Diacenode Bioruptor和Sonicator 30 s。用FOXO1（2880，细胞信号技术） ，IgG（2729S
，细胞信号技术）或STAT3（9139，细胞信号技术）抗体对可溶性染色质进行免疫沉淀 。免疫沉淀的染色质被磁蛋白A/G珠（88803 ，Pierce）捕获
。免疫沉淀的染色质用低盐缓冲液洗涤3次（0.1％SDS（0.1％SDS（15553-035，Invitrogen）
，1％Triton X-100，2 mm EDTA pH 8 ，20 mm Tris-Hcl pH 8和150 mm NaCl和150 mm NaCl）
，高-SALT BUFFER三次（0.1％SDS，1％SDS ，1％xd imm x）TRIS-HC-L pH 8
，500 mm NaCl），LICL缓冲液3次（0.25 m LICL（62476 ，Sigma-Aldrich）
，1％NP-40，1 mm EDTA PH 8 ，10 mm Tris-Hcl PH 8
，1％deoxychaly）和TE Tris-Hcl PH 8，1％sodium-Hcl pH 8 ，10毫米 在洗脱缓冲液中洗脱之前（50 mM Tris-HCl pH 8，10 mM EDTA
，1％SDS）。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（28106，Qiagen）纯化洗脱染色质 。BMF和GATA3启动子在免疫沉淀的染色质中使用QPCR使用Perfecta Sybr绿色超级粘合反应混合物（95054-500 ，Quantabio）和下面列出的引物测量
。计算每个免疫沉淀的输入值百分比。通过标准化每个免疫沉淀的适当IgG控制的百分比输入来计算倍数变化富集值 。 　　如前所述70
，将N端HA-TAG引入了BMF的内源基因座
。将CRRNA（5'-TTGCCCCCTCAGAGGAGAGA-3'）与Alt-R CRISPR-CAS9 TRACRNA（IDT，1073190）在95°C杂交5分钟 ，以等效率（0.375 Nmol）。将混合物冷却至台式上的室温10分钟
，然后加入2 µL Alt-R S.P.Cas9核酸酶V3（IDT，1081059）和5 µL 100 µm单链供体寡核苷酸（5'-GCTGAGGGGGGGGCAGTCCAGTAGGCTGCTGGGCAAACAGGTCAGAGAGAGAGAGCTCCCGGGTTGGGTGGTCCGGTCGCCCCCCCCCATCCTCTCTGGTGGTGGAACACACACACACACATCAtcctccagctcctcccacacacactgagatggctcagcgtaatctggtaCgtCgtCgtCgTaTggTaCatctctctctcctgtgggggggggggggcagcaggcagcagcagcagcagcagcatctggctgctgctgct-3'） 。将混合物在室温下孵育20分钟 ，并添加到150万（MDA-MB-468）或100万（HCC1395）细胞中
，重悬于100 µL的SF细胞系核对象溶液中（Lonza，V4XC-2012）
。然后将细胞转移到比色绿色中 ，并使用4D-核对象X单位（LONZA）中的EO-117程序进行核法。 　　如前所述进行剪切和运行 。简而言之
，使用DMSO处理的MDA-MB-468细胞的500,000个核，使用核萃取缓冲液（20 mM HEPES pH 7.9 ，10 mm KCl，10 mm KCl
，0.1％X-100 X-100，20％glycerol和1mMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMN然后将核样品固定到生物群中 ，加那瓦林A（con A）涂层磁珠（刘海实验室）
，这些磁珠（刘海实验室）通过用冷珠激活缓冲液（20 mM HEPES pH 7.9，10 mM KCl ，1 mm caCl2
，1 mm Cacl2，1 mm MM MNCL2）激活3次。将CONA珠/细胞混合物重悬于冷抗体缓冲液中（20毫米HEPES pH 7.5 ，150 mm NaCl
，0.5 mm的精子，1×Roche Complete ，Mini
，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂 ，0.01％Digitonin，2 mm EDTA）
，然后将其与0.5μg固定在0.5μg中
。9733）和H3K4me3（CST，9733）或IgG（Epicypher）在4°C冷藏室中过夜。将未结合的抗体用冷的digitonin缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5 ，150 mm NaCl
，0.5 mm的精子定，1×Roche Complete ，Mini
，Mini，无EDTA无蛋白酶抑制剂 ，0.01％Digitonin）洗涤3次 。然后将CONA珠/细胞混合物重悬于50μl冷数字蛋白缓冲液中
，并在4°C的冷空间中与我们的自制PAG-MNase一起在营养器上孵育一个小时
。未结合的PAG-MNase用冷数字蛋白缓冲液洗涤3次。通过添加CaCl2激活MNase，并在4°C的冷室中孵育30分钟 ，以裂解并释放抗体结合的染色质 。通过添加冷停止缓冲液（340 mM NaCl
，20 mM EDTA，4 mM EGTA ，50μgml-1 RNase A，50μgml-1糖原
，1pgμl-1 E.1 E.1 E. e. e.coli Spike-In DNA）来停止反应
。然后通过在37°C下孵育10分钟来释放裂解的染色质。可以使用磁珠来收集上清液中的切割和运行的DNA，并使用Monarch PCR和DNA清理套件（NEB T1030L）纯化 。使用NEBNEXT ULTRA II DNA库Prep Kit（NEB） ，使用10 ng剪切和运行DNA制备切割和运行的库 根据制造商的协议
。在Illumina NextSeq 2000系统中对库进行了测序
，2×50 bp配对读数。 　　使用Bowtie2和设置为“ - 非常敏感的 - 不混合-no-discordant -phred33 -i 10 -x 700'72”，将配对端的FASTQ文件与HG38参考基因组对齐 。测序读数也与大肠杆菌基因组对齐以绘制峰值读数
。对于峰值归一化 ，使用映射到大肠杆菌基因组的映射读数总数来计算切割和运行样品的归一化因子。使用SamTools73将SAM文件转换为BAM文件 。使用DeepTools74从BAM文件生成大翅文件。使用Integrative Genomics Viewer（IGV）75生成了大文件的基因组浏览器轨道
。使用callpeak函数使用“ -f bame -ekep -Dup 1 -q 0.05 ”
，使用callpeak函数来调用峰，并将IgG用作对照76。使用选项“ Spikein = true
”的DiffBind R包中的DESEQ2分析用于比较条件之间的差异结合（FDR <0.1）77 。 　　使用Rneasy Plus套件（74134 ，Qiagen）分离RNA
。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（4368814
，Thermo Fisher Scientific）将RNA反转录为cDNA。QPCR使用Perfecta Sybr Green Supermix反应混合物（95054-500，Quartabio）和下面列出的引物完成 。将CQ值标准化为stau1作为参考基因
。 　　人类乳腺癌组织阵列BRC482购自哑剧学 ，由16例组成
，一个正常的乳腺组织核心与每个患者的两个肿瘤组织核心配对。如前所述，使用基于组织的循环免疫荧光（CYCIF）制备了PDX样品和组织微阵列的FFPE切片 ，并分别用23个PLEX和33-PLEX抗体面板染色 。烘烤和脱水：为了准备抗体染色的样品，载玻片上的组织切片经过了Leica Bond Rx机器促进的自动化过程
。该协议从60°C的30分钟烘烤步骤开始。随后
，将载玻片在72°C的键露水溶液中进行脱瓦，然后使用键表位置检索溶液1（ER1）在100°C下进行20分钟的抗原回程步骤 。摄影和自动荧光降低：在烘烤和脱水步骤后 ，将载玻片浸入漂白溶液中（4.5％H2O2
，1×PBS中的NaOH 20 mm NaOH），并暴露于LED光1小时以减轻自动荧光
。通过用1×PBS（每个10–15 s）洗涤幻灯片 ，清除过量的漂白溶液。随后
，将载玻片在4°C下在黑暗中孵育过夜，并在超级阻止缓冲液中稀释的二级抗体（1：1,000； Thermo Fisher Scientific ，37515） 。温育后
，将载玻片用1×PBS洗涤六次，并再次光漂白1小时。抗体染色 ，盖玻片安装和成像：对于每个CYCIF循环
，在没有光线33342（1：10,000; Thermo Fisher Scientific，62249）的情况下将样品在4°C下孵育过夜 ，以进行核染色
。同时，引入了初级抗体
，这些抗体是共轭或未缀合的，在超块阻止缓冲液中稀释（Thermo Fisher Scientific ，37515）。如果将主要抗体未缀合
，则 随后在室温下在黑暗中进行1小时进行二抗 。染色后，幻灯片用1×PBS进行了一系列的六个10 s洗涤 ，然后使用80-100 µL 50％的50％甘油将它们安装在24×60 mm的盖玻片上
，并在室温下干燥30分钟
。一旦盖上覆盖，将使用带有以下通道的Rarecyte Cytefinder II HT系统进行自动成像：UV ，CY3
，CY5和CY7。成像参数保持一致，如下所示：binning：PDX全曲线图像1×1；TMA的binning 2×2；目标：×20;数值孔：0.75;分辨率：0.325 mm PX -1 。对每个通道进行微调图像暴露以防止信号饱和度 ，但在样品之间均匀地保持
。在囊状循环之间
，将覆盖片浸入1×PBS（每个容器5个载玻片）中的容器中，在室温下10分钟来覆盖。在启动随后的抗体染色周期之前 ，将载玻片光漂白1小时，以停用荧光团并在PBS中再次洗涤六次以去除残留的漂白溶液 。使用基于Docker的Ne​​xtFlow Pipeline McMicro处理获得的图像
。最初
，来自Cytefinder II HT的原始图像通过基本模块进行了照明校正。随后，它们使用Ashlar模块缝制并注册 ，从而产生了每个幻灯片的组装OME.TIFF文件 。完整代码可在GitHub（https://github.com/labsyspharm/mcmicro）上获得
。 　　抗体如下：CK14（ABCAM
，AB77684，LL002 ，与FITC相连
，1：500），CK8（Ebioscience ，11-9938-80
，lp3k，lp3k ，与FITC相连
，1：400），pan-ck（ebioscience ，ebioscience，53-9003-82
，AEJ 1/eejug，af affc sej affc ，fitc
，fitc，fitc ，ck82-9003-82
，conj of fitc，ck8。1：1,000） ，EZH2（CST
，45638，D2C9 ，偶联至AF647
，1：100），CPARP（CST ，6987S，D64E10
，与AF647，1：100结合使用）（Invitrogen A-31572 ，与AF555
，1：1,000相连）和抗小鼠IgG（Invitrogen，A-31571 ，与AF647
，1：1,000共轭） 。 　　为了计数ERV的读取，从ERVMAP数据库中收集了ERV基因座信息78。鲑鱼（V.0.14.1）79用于创建一个定制的参考转录组集 ，其中包括人类基因组转录组（HG38）和ERVMAP数据库
。使用数据库
，通过鲑鱼对用DMSO或EZH2I TazeMetostat处理的MDA-MB-468细胞的RNA-SEQ数据进行了定量。DESEQ2用于计数归一化和差异表达分析 。 　　RT – QPCR的引物如下5' -3'取向：STAU1（FWD：GGATGAGTTCAGGATGCCTTAT，REV：GGTGTGTGTGTCCTTGACTAACT） ，BMF（BMF）（FWD：CTCATTAAGCCCAAGCGAAG
，REV：GTCTGACAGTTCGCACAGGA），FOS（FWD：GTCTTCCTTCGTCTCCACCTAC ，REV：GAGTCAGAGGGCTCTCATCACPDK4（FWD：GCCTTCCCTTACCACAATAGAG，REV：GTTGGTGCAGTGGAGTATGT）
，SCNN1A（FWD：GGCTGTGCCTACATCTTCTTCTC，REV ，REV：GAGAAGTCAACTCACTCTGGCTTAG）caaacttggtctggtcttca）
，igfbp5（fwd：gaagaaggaccgcgcagaaagaa，rev：ctcagactcctgtctcatcatca） ，tnfrsf21（fwd：fwd：ccaacttttcttcttgcctgtgtag
，rev，rev：gagggggggggggttcttctccccccactccccccccccatctccatctccantc ，,,CGCACACTGTCCCAATTCTA
，REV：TCTGTACCCCAGCCTATCTTT）
。芯片– QPCR的引物在5' -3'方向中如下：GATA3启动子（FWD：TTGGTGCTCGCGCGCGATTGAA，REV：AAATGCTGACTTCTGCTAA） ，GATA33增强子（FWD：ATCCATCAGCCCCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCTTCTCTTCTCTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTCTTATT。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。