人多巴胺转运蛋白的结构和抑制机制

　　将HDAT cDNA（UNIPROT ID Q01959）克隆到PEG-BACMAM Vector48中，具有N端His-Strepii-EGFP TAG和EGFP TAG和HDAT蛋白质编码序列的EGFP标签之间的3C蛋白酶位点（LEVLFQGP） 。该构建体还具有蛋白水解不稳定56氨基酸的N末端缺失 ，并包括恒温突变（I248Y）
，如前所述21，并将被称为δ-HDAT
。使用由DNA测序验证的位置定向诱变引入点突变。 　　如先前所述的21 ，在标准方案48之后进行了细菌病毒介导的Δ-HDAT表达
，并进行了较小的修改 。简而言之，用3.5至4.0×106个细胞的HEK293 GNTI-（RIC-15）细胞31细胞用Δ-HDAT P2病毒在2.5的多种感染中转导 ，并在37°C的37°C中以8％CO2添加12 h，添加12 h
，然后由10 h，含10 h ，含10 h
，含10 h的erlenmeyer烧瓶中培养
。随后，转导的培养物转移到30°C ，并孵育48小时。通过以4,000 rpm离心15分钟（TX 1000转子
，Thermo Scientific）通过离心收集细胞，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中洗涤 ，在液氮中冷冻
，并在-80°C下储存，直到进一步使用 。将细胞颗粒解冻在冰上 ，并重悬于由50 mM HEPES pH 7.8、200 mM NaCl和20％甘油中的重悬缓冲液中
，并补充了20％的甘油，含0.8μm的折断蛋白 ，2μgml -1 Leupeptin，2μmpepstatin A和2μmpepstatin a和1mmMMMMMM MM苯基甲基甲基甲基甲基甲基素（PMM）。通过超声处理将细胞裂解
，并以40,000 rpm离心60分钟（45型Ti转子）以颗粒膜
。在重悬的缓冲液中使用Dounce均匀的均匀剂重悬于膜颗粒，其中将甘油浓度升高至30％ ，闪存冷冻
，并储存在-80°C下。除非另有说明，否则所有离心步骤均在4°C下进行 。 　　Frozen membranes from 4.8 l of culture were thawed on ice and solubilized in a solution of 10 mM lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG), 2 mM CHS, 50 mM HEPES pH 7.8, 200 mM NaCl, 10 μM MRS7292, 2 μM β-CFT, 0.8 μM aprotonin, 2 μg ml−1 leupeptin,在4°C下恒定搅拌约3小时 ，pepstatin A和1 mM PMSF
。通过以40,000 rpm的超速离心阐明所得的溶液60分钟（45型Ti转子）。同时
，通过将GFP-Nanoboty蛋白与CNBR Sepharose树脂偶联以1 mg ml-1的浓度来制备，以0.1 mm lmng ，0.02 mm CHS
，50 mm chs，50 mm Hepes pH 7.8 ，200mmMM Nac
，以1 mg ml-1的浓度平衡棕榈酰-2-烯酰基-SN-甘油-3-磷脂（POPC）和10％甘油 。将预衡的GNB树脂添加到溶解的膜上清液中，以在4°C下的3D振动器下在批处理模式下结合3小时
。然后将蛋白质结合的GNB树脂包装到重力柱中 ，并用总共12列的洗涤缓冲液洗涤，包括0.06％Digitonin
，0.006％CHS，50 mM HEPES pH 7.8 ，200 mm NaCl
，NaCl，25μmPOPC ，10％甘油
，10％Glycerol，10％MRS7292 ，2μmmmS7292
，2μmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmβ-cft。将无标签的δ-HDAT蛋白在含3C蛋白酶的洗涤缓冲液中洗脱过夜，浓缩并通过0.02％digitonin ，0.002％CHS
，50 mm HEPES pH 7.8，200 mm NaCl ，200 mm NaCl，4μmMMMMS7292
，500 nmmms7292，500 nmβ-cftc和25μmmMMMHepes pH 7.8 ，200 mm NaCl和25μmmMMMMMHepes pH 7.8
，200 mm NaCl和25μmmmMMHepes pH 7.8，200 mm NaCl和25μmmmMM浓缩和进一步纯化 。 　　使用100 kDa截止过滤器将SEC纯化的δ-HDAT蛋白浓缩至约7 mg ml-1 ，并立即用于制备冷冻EM网格
。通过在15 mA处发光释放30 s
，将孔网格（量子R 1.2/1.3 AU 200元）通过发光释放剂提供亲水性，并立即使用。将3μl浓缩δ-HDAT的溶液施加到网格上 ，并在15°C时在100％湿度中静置3 s
，然后使用Vitrobot Mark IV IV IV Vitrification System（Thermo Scientific）在液体乙烷中浸泡100％湿度 。使用配备有Falcon4i直接电子检测器的Titan Krios（300 KeV）显微镜收集冷冻EM数据，并选择了Selectris X Energy Filter（Thermo Scientific）和Serialem V4.1.0 Beta24软件
。使用-1.0至-2.5 µm的散焦范围 ，总剂量为50 e -Å -2
，物理像素大小为0.743Å，以及能量滤波器的缝隙宽度为6 eV。 　　将EER50格式的14,460个冷冻EM图像进口到CryoSPARC ，版本4.2.1和4.4.051，并使用斑块运动校正校正了运动
，然后进行了造影剂转移函数（CTF）的估计和策划显微照片 。丢弃了CTF不良的显微照片，总共有14,277个显微照片以进行进一步的图像处理。通过使用具有80Å和150Å小轴和主要轴的椭圆形斑点进行无参考的斑点拾取颗粒
。最初 ，总共选择了7,117,202个颗粒。然后将颗粒的盒子尺寸为256像素
，傅立叶裁剪为64像素，并进行多发2D分类 。在三轮2D分类中选择了显示有希望的跨膜螺旋特征的2D类 ，其次是基于AB的3D重建和分类52
。简而言之
，具有以下参数的重复作业中生成了四个Ab Initible类：初始批量大小：300；最终批量大小：1,000；最终迭代的数量：500；最大对齐分辨率：8Å；和初始对齐分辨率：20Å。从两种重复架中汇总了具有不同跨膜螺旋的最佳类别的颗粒，并取出了重复项 。接下来 ，以与上面相同的盒子尺寸重新提取颗粒
，傅立叶裁剪两倍
。如上所述，随后进行了2D分类 ，然后重复基于AB的3D重建 - 分类 - 但最大和最小比对分辨率分别为6Å和12Å。然后选择了最好的类
，并如前所述合并粒子 。最后，重新提取颗粒 ，而没有任何傅立叶裁剪，盒子大小为384像素
，并且基于先前的分类进行了以前描述的，分别以8Å和4.5Å的初始和最大对齐分辨率分别进行了描述
。 最终迭代设置为350。选择最明确的δ-HDAT特征的类用于合并颗粒 。去除重复项后 ，将颗粒用于不均匀的修补53
，初始低通分辨率为12Å，然后再进行四次额外的细化 ，而最小化每粒子尺度尺度参数
。基于177,494个颗粒的傅立叶相关性（FSC）截止
，不均匀的细化导致δ-HDAT图的3D重建，分辨率为3.19Å。 　　通过使用刚体拟合拟合HDAT的AlphaFold衍生的Model54（AF-Q01959-F1）来解释δ-HDAT的最终冷冻EM图 。N端56残基在δ-HDAT的字母模型中截断。然后 ，使用COOT（V0.9.8.6）56手动调整拟合模型和MAP
，然后以迭代方式使用Real Space Refinement58在Phenix V1.20.1.1-448757中进一步完善
。MRS7292化合物的约束是使用Phenix中的肘程序生成的，并在随后的完善步骤中使用。Molprobity59用于评估几何约束 ，所有原子冲突得分和Ramachandran统计的精制模型的质量
，并使用检查我的金属来评估Zn2+和Na+ Site ContereChemistry 60 。使用Phenix中的综合验证计划用于获得最终的完善统计数据（扩展数据表1）
。为了评估在细化过程中的过度拟合，比较了FSCWORK和FSCFRE曲线61,62。Δ-HDAT坐标使用phenix中的PDB工具摇动 ，随机移位为0.5 r.m.s.d.使用α-碳原子将所得模型与输入模型进行了超级伪造，以确认R.M.S.D的变化 。该动摇模型针对两张半映射之一进行了完善
，并将所得的模型映射FSC曲线称为FSCWork
。使用该摇摆的模型和其他半映射（未在任何细化中使用）的MAP-VERSUS模型曲线是使用Phenix中的综合冷冻EM验证工具获得的。该FSC曲线称为FSCFRE 。绘制并分析了FSCWork和Fscfree曲线，以使其过度拟合
。使用Pymol（Pymol Molecular图形系统 ，2.5.5
，Schrödinger）和Chimerax v1.6.155制备结构图和插图。 　　使用Swiss Model Server63和HSERT（PDB：7LI6）作为模板生成内向开放构象的模型 。 　　用Δ-HDAT和全长HDAT P2病毒转导HEK293 GNTI-细胞，使用“蛋白质表达和纯化”中所述的标准方法在SF9细胞中传播 ，在每个mL的细胞密度为2.5 - 3.0×106细胞中
，然后在37°C下孵育6小时
。6小时后，将丁酸钠添加到最终浓度10 mm ，并将细胞用8％CO2转移至30°C
，持续6小时。将转导的细胞以每孔为100,000个细胞的密度将96孔聚赖氨酸涂层的异磷酸盐（Perkin Elmer）接种 。然后将板在启动摄取测定之前在30°C下孵育12-16小时。最初，用37°C的摄取测定缓冲液洗涤细胞 ，由25 mM HEPES pH 7.4 、120 mM NaCl
，5 mM KCl，1.2 mm CaCl2
、1.2 mM MGSO4、5 mm--葡萄糖 ，1毫米 - 抗甲酸和1 µm RO 41-0960的buffation in 50 min，Incuub in Incub in Incub in in Incub in Incub
，1 mm -glucose，1毫米
。在摄取测定缓冲液中使用10 µm的GBR12909复制来测量背景。为了评估MRS7292对摄取的影响 ，将10 µM MRS7292添加到摄取缓冲液中 。然后将细胞与50 µL的[3H]多巴胺一起在摄取测定缓冲液中的特异性活性为45.6 CI MMOL -1（热：冷的比率为1：100）
，浓度范围为30至0.0137 µm，持续10分钟
。通过添加100 µL冷藏抑制缓冲液 ，摄取测定缓冲液
，添加了2.5 µM GBR12909，可以停止吸收反应。进行两次用100 µL抑制缓冲液的连续洗涤 ，然后在100 µL的1％Triton X-100中重悬于细胞中 。最后
，将100 µL液体闪烁鸡尾酒添加到每个孔中，并使用Microbeta2（Perkin Elmer）测量[3H]
。平均三个重复的背景计数并从总数中减去。数据适合Michaelis -Menten方程 ，以确定三个独立实验的多巴胺摄取的动力学参数（n = 3个生物学重复
，从转导开始）， 每个都有一式三份测量 。 　　对于[3H]多巴胺在∆-HDAT突变体上的摄取实验 ，如上所述，将HEK293 GNTI-细胞转导并孵育
。对于MRS7292化合物的IC50测量
，用W84A，W84C ，W84C
，D385A，D385N ，D385N
，V364I，Y394F ，M414L
，M414L，M414L ，I390L和I390L和V364I/I390L MUTISTING WISS KUTING WISSKINK WASTED WASTED WISSKIK WASTED FARSERER WINCER fiff FISTER iCKINK iCKINK WISTER fiff FISTER iCKINK iCKING iCKERIK WASTER fiff FISTER
，MRS7292的浓度范围为30至0.0411 µm（M414L突变体的10至0.0137 µm）持续20分钟。使用含有10 µM GBR12909的重复物来测量背景 。为了启动摄取，加入25 µl 50 nm [3H]多巴胺（35.5 CI Mmol -1） ，并将细胞孵育10分钟
。通过添加50 µL冰冷的抑制缓冲液来淬灭摄取。如前所述，进行了随后的洗涤步骤和放射性测量 。 　　对于Zn2+的IC50测量
，如MRS7292所述进行了摄取测定，并进行了以下更改。摄取缓冲液在pH 8.5上包含EPP代替HEPES
。用含有1 mM乙二胺乙酸（EDTA）的摄取缓冲液洗涤细胞一次 ，以从细胞生长培养基中螯合了环境Zn2+
，然后在没有EDTA的第二次洗涤中。然后，将细胞在含0.3-300 µm的摄取缓冲液中孵育15分钟 ，为∆-HDAT添加了Zn2+
，T211H添加了0.1-100 µm的Zn2+，T211E添加了0.03–30 µm的Zn2+ 。在没有添加的Zn2+的情况下 ，使用具有1 mM EDTA的缓冲液获得[3H]多巴胺吸收的测量值
，以螯合环境Zn2+
。在pH 7.5下还测量了T211E突变体的Zn2+的IC50，以获得更完整的抑制曲线。摄取缓冲液的元素分析揭示了在约100 nm处存在的环境Zn2+ 。IC50图中使用了估计的“游离 ” Zn2+浓度 ，在1 mM EDTA洗涤过程中
，我们假设“零
” Zn2+，并且在随后的Zn2+浓度中 ，我们估计，来自摄取的ZN2+浓度大约是100 nm环境Zn2+
。 　　通过从总数中减去背景计数（从技术三份平均）中获得特定计数。使用GraphPad Prism v7.05绘制了针对MRS7292或Zn2+浓度的对照百分比的特定摄取活性 。MRS7292和ZN2+ IC50测量值分别将MRS7292和1 mM EDTA的特定吸收活性设置为100％
。使用GraphPad Prism v7.05中的非线性回归模型拟合了数据点：[抑制剂]与归一化响应具有可变斜率：用于分析MRS7292和[抑制剂]与具有可变斜率响应的抑制作用：用于分析Zn2+抑制抑制作用。从三个独立的实验（n = 3个生物学重复开始）收集数据
，每种都用三个技术重复执行 。 　　对于SPA64，如“蛋白质表达和纯化”中所述纯化了His标记的∆-HDAT蛋白 ，但使用链球链球菌树脂
，利用双链球菌亲和力标签，没有β-CFT（WIN35428）
。各种缓冲系统没有变化。在SEC缓冲液（0.02％Digitonin ，0.002％CHS
，50 mM HEPES pH 7.8，200 mM NaCl ，25 µm POPC和4 µM MRS7292）中
，将1 mg ML-1的YSI-CU SPA珠添加到∆-HDAT（30 nm）中 。[3H] -WIN35428（82.8 CI MMOL-1）在20 mm HEPES pH 7.8中，浓度为0至150 nm ，使用100 mM NaCl。为了进行背景测量
，将100 µM的GBR12909添加到测定缓冲液中
。将反应物添加到96孔等板上，在室温下短暂混合在振荡器上 ，并使用Microbeta2记录[3H]计数。从三个独立的实验（n = 3）收集数据，每个实验都使用相同的纯化蛋白质样品一式三份进行技术 。通过GraphPad Prism v7.05中的非线性回归分析
，通过单位结合模型绘制和分析了背景减去计数
。 　　除了配体（β-CFT和MRS7292）和Zn2+离子之外，使用δ-HDAT冷冻EM结构来制备模拟系统。使用SchrödingerPrime Module65（Schrödinger版本2023-2：Prime ，Schrödinger）对缺失的障碍区域（EL2）进行建模
，并使用预先蛋白质的Wizard66来分配可滴定残基的质子化状态 。除His129外，所有组氨酸残基均分配为中性（HID） ，而His129是质子化的（髋）
。在CYS180和CYS189之间引入了二硫键。使用VMD69的Dowser插件67,68对蛋白质进行水合 。然后使用CHARMM-GUI膜构建器70构建初始脂质双层以嵌入蛋白质
。双层中蛋白质的取向来自膜（OPM）数据库中蛋白质的方向71。随后
，将结构插入到异质的脂质双层中，并去除呈空间上的脂质分子 。双层由POPC和胆固醇（CHL）组成 ，百分比为3：2
。将40-ÅPIPT3P水分子的平板放置在双层上方和下方。添加Na+和Cl-柜台以将系统中和总盐浓度为0.15 m
，从而导致整个模拟单位细胞（102Å×102Å×134Å），含有约122,000个原子 。LEAP用于分配系统中所有分子物种的力场参数。分别使用Amber FF19SB72 ，Lipid2173和TIP3P Water74的单价离子参数来描述δ-HDAT蛋白
，脂质，Na+和Cl-ION和TIP3P水
。使用Li – Merz参数75描述了Zn2+离子 ，用于高电荷金属离子。Cufix校正76被应用于特定的带电化学部分对之间的非键相互作用 。使用OPLS4力野战77的LIGPREP最小化β-CFT和MRS7292结构
。此外， EPIK78以7.0±2.0的pH值实现了这些配体的离子状态。琥珀色力场2（GAFF2）79,80个参数集用于配体（β-CFT和MRS7292） 。补充图2中描述了典型的系统设置
。 　　使用Amber2081套件和PMEMD.CUDA模块进行所有模拟。为了消除系统中溶质和溶剂水分子之间的不良接触
，在生产运行之前，在三个阶段进行了能量最小化和平衡模拟 。首先 ，在对脂质和溶质重原子上应用谐波约束时进行了能量最小化（k = 10 kcal mol –1Å -2）
。然后将整个系统最小化10,000个步骤
，然后使用最陡的下降算法和共轭梯度方法再增加5,000步的能量最小化。其次，进行了两步平衡模拟 。首先将系统从0 K加热到大约100 K ，然后在NVT集合中逐渐使用蛋白质和脂质约束100 ps的310 K
。随后
，所有模拟的复合物在310 K和1个atm处进行了10个不受约束的NPT动力学（5 ns，每个）的重复。最后 ，使用周期性边界条件
，在310 K和1 ATM的NPT集合中为每个复合物进行了1.0 µs的生产模拟 。分别使用Langevin Thermostat82和Monte Carlo Barostat83维持温度和压力。使用粒子网埃瓦尔德（PME）84方法，用10Å的距离切口计算静电相互作用
。Shake算法85用于维持涉及氢的键的所有限制 ，并且时间步长设置为2.0 fs。我们总共进行了五个独立的复制品
，导致累积采样为5 µs（每个5次×1 µs），并存储500,000帧 。 　　为了进行可视化和分析 ，我们将VMD69和Ambertools2286,87与内部脚本一起使用
。为了量化HDAT的堆叠：W84和MRS7292，我们为它们的两个环形成堆叠相互作用时建立了一个阈值。The threshold is based on the distance between the heavy atom centres of masses (COMs) of the indole ring of W84 (atoms: CG, CD1, NE1, CE2, CZ2, CH2, CZ3, CE3 and CD2) and the adenine ring of MRS7292 (atoms: N3, C4, N1, C3, C5, N4, C6, N5 and C2).我们认为
，如果MRS7292和W84分子的COM距离≤5Å，并且它们的环正态之间的角度≤45° 。使用VMD69中的内部TCL脚本计算出每组联系人配置文件
。对于每次运行中的每个快照 ，分别计算出每个重原子对与配体和蛋白质之间的距离
，并且认为≤4Å的距离被视为接触。在整个轨迹中，如果残基与配体的接触率超过总时间的40％以上 ，则被指定为具有稳定的接触 。 　　SF9细胞生成杆状病毒和重组抗体片段的表达来自Thermo Fisher（12659017
，Lot 421973）
。这些研究未通过实验对细胞进行身份验证。使用Bionique中的细胞铸造剂检测KIT M-100测试细胞对支原体污染的阴性 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。