多级蛋白质组学揭示了SARS-COV-2和SARS-COV的宿主扰动

　　没有使用统计方法来预先确定样本量 。实验不是随机的
。在实验和结果评估中 ，研究人员并未对分配视而不见。 　　HEK293T
，A549，VERO E6和HEK293-R1细胞通过PCR-环核 - 局限性技术进行身份验证及其各自的培养条件以前被描述为55 。所有细胞系都经过测试为不含支原体。合成了C末端HA标签的病毒开放式阅读框架（扭曲生物科学和生物剂） ，并将其克隆到PWPI载体中，如先前所述56
，并进行了以下修改：添加了一个启动ATG密码子，内部规范的拼接位点被同义突变和codon添加了一个codon ，然后添加了codon
。从ACE2表达载体（S.Pöhlmann提供）57中将C端标记的ACE2序列放大到慢病毒载体PWPI-PURO中。将A549细胞转导了两次
，并选择了紫霉素的A549-ACE2细胞 。如前所述52进行慢病毒的产生，细胞转导和抗生素选择
。RNA分离（Macherey – Nagel核素RNA Plus） ，逆转录（带有GDNA橡皮擦的Takara Bio Primescript RT）和带有逆转录（RT – QPCR）（RT-Fisher Scientific Sc​​ientific Powerup sybr绿色）的定量PCR进行了如前所述。根据制造商的协议（Qiagen rneasy mini套件
，RNase Free DNase集）进行了下一代测序应用的RNA隔离 。For detection of protein abundance by western blotting, HA–horseradish peroxidase (HRP) (Sigma-Aldrich; H6533; 1:2,500 dilution), ACTB–HRP (Santa Cruz; sc-47778; 1:5,000 dilution), MAP1LC3B (Cell Signaling; 3868; 1:1,000 dilution), MAVS (Cell Signaling;3993; 1：1,000稀释），HSPA1A（细胞信号； 4873; 1：1,000稀释） ，TGF-β（细胞信号传导; 3711; 1：1,000稀释）
，磷酸p38（T180/y182）或SARS-COV N蛋白（Sino生物学; 40143-MM05; 1：1,000稀释） 使用抗体
。二级抗体检测小鼠（细胞信号； 7076; 1：5,000稀释；杰克逊免疫疗法； 115-035-003; 1：5,000稀释），大鼠（Invitrogen; 31470; 1：5,000稀释）和兔IgG（细胞信号传导; 7074; 1：5,000稀释）对于AP-MS和亲和力纯化 - 西方印迹应用 ，使用了HA珠（Sigma-Aldrich和Thermo Fisher Scientific）和链霉素II珠（IBA Lifesciences）。如上所述进行了蛋白质印迹的成像 。重组人IFN-α用于刺激报告基因测定中的细胞是P.stäheli（弗莱堡大学病毒学研究所）的礼物
，重组人IFN-γ是从peprotech购买的，而IVT4则如前所述生产
。在补充表9中列出了病毒抑制剂测定中测试的所有化合物。 　　SARS-COV-FRANKFURT-1 ，SARS-COV-2-MUC-IMB-1和SARS-COV-2-GFP菌株43是通过感染在DMEM培养基中培养的VERO E6细胞（10％FCS，10％FCS
，100μgml-1链霉素，100 IU ML-1 Penicillin）的VERO E6细胞产生的 。在-80°C存储之前 ，收集病毒量并旋转两次（1,000克10分钟）
。通过斑块测定确定病毒量的滴定。Vero E6细胞的汇合单层在37°C下用五倍的病毒上清液感染了1小时 。除去接种物
，并用含有0.5％羧甲基纤维素（Sigma-Aldrich）的无血清MEM（Gibco，Life Technologies）代替。感染两天后 ，将细胞在室温下固定20分钟
，甲醛将室内添加到培养基中，最终浓度为5％
。在用含有1％晶体紫罗兰色的水和10％乙醇染色之前 ，用PBS广泛洗涤固定细胞
，持续20分钟。用PBS冲洗后，计数斑块的数量并计算了病毒滴度 。 　　在随后的实验中 ，用SARS-COV-FRANKFURT-1或SARS-COV-2-MUC-IMB-1菌株（MOI为2）感染A549-ACE2细胞
。在每个时间点
，将样品用1×TBS缓冲液洗涤一次，并在脱氧胆酸钠（SDC）裂解缓冲液（100 mM Tris HCl PH 8.5; 4％SDC）中进行蛋白质组 - 磷酸蛋白酶 - 启发蛋白组 - 泛素组分析 ，Dodecyl硫酸钠（SDS）溶解Buffer（62.5 mmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM）甘油; 50 mM DTT;用于蛋白质印迹的0.01％溴酚蓝色或用于转录组分析的缓冲液RLT（QIAGEN）。将样品热灭活并在-80°C下冷冻直至进一步加工 。 　　确定SARS-COV-2和SARS-COV的相互作用以及辅助蛋白的相互作用（由HCOV-229E的ORF4或ORF4A编码HCOV-NL63的ORF4A或ORF4A）大概代表了ORF3和ORF3和ORF3A蛋白的同源物，并相应地将SARS-COV-COV的每个蛋白质均表现出来
，并相应地均相应地进行了sars-cov-2病毒蛋白
。用编码HA标签的SARS-COV-2，SARS-COV或HCOV-229E/NL63蛋白质和蛋白质裂解物的慢病毒载体转导A549细胞（每15厘米盘6×106个细胞） ，并从收集到3天后收集的细胞制备了蛋白质。在裂解缓冲液中裂解来自两个15厘米菜的细胞颗粒（50 mm Tris-HCl pH 7.5
，100 mm NaCl，1.5 mm MgCl2 ，0.2％（v/v）NP-40
，5％（v/v）甘油（v/v）甘油，完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（ROCHE） ，0.5％（ROCH）
，v/v/v/v/v/v/v/v/v）750 u（v）750 ul（v）4°C，30 s开 ，30秒钟
，低设置；在蛋白质浓度的清除裂解物的标准化之后，通过在4°C下持续搅拌3 h ，通过添加50μl抗Ha-Agarose浆液（Sigma-Aldrich，A2095）来富含病毒结合的宿主蛋白 。通过裂解缓冲液进行四次洗涤
，然后用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mm NaCl ，100 mM NaCl
，1.5 mM MGCL2，5％（V/V）Glycerol）去除非特异性结合蛋白
。通过添加200μl消化缓冲液（0.6 m氯化物 ，1 mm Tris（2-羧乙基）磷酸（TCEP）（TCEP）
，4 mm氯乙酰基（CAA），100 mm Tris-Hcl PH 8 ，0.5 p pH 8
，0.5 g lys（wako g lys）在30°C下的胰蛋白酶（Promega）过夜。树脂; 并使用Easy-NLC 1200系统（Thermo Fisher Scientific）进行分离 。A binary buffer system consisting of buffer A (0.1% formic acid (FA) in H2O) and buffer B (80% acetonitrile (ACN), 0.1% FA in H2O) with a 90-min gradient (5–30% buffer B (65 min), 30–95% buffer B (10 min), wash out at 95% buffer B (5 min), decreased to 5% buffer B (5 min),和5％缓冲液B（5分钟））以每分钟300 nl的流速使用
。直接在激活HF质谱仪（Thermo Fisher Scientific）上直接分析洗脱肽。依赖数据的获取包括在3×106的离子目标上重复一次MS1全扫描（300–1 650 m/z，r = 60,000时为200 m/z） ，然后进行15 ms2的扫描
，进行最高丰富的分离型和高能量的碰撞和较高的碰撞碰撞（HCD）extelded（HCD）extelded肽肽（HCD）expted肽肽前沿（r = 15,000 m/z） 。对于MS2扫描，分离的肽前体的收集受到1×105的离子靶标的限制 ，最大注射时间为25 ms。通过动态排除20 s消除了同一肽前体的分离和碎片化
。将四极杆的隔离窗口设置为1.4 m/z，HCD设置为27％的归一化碰撞能。 　　For the determination of proteome changes in A549 cells expressing SARS-CoV-2, SARS-CoV, HCoV-229E or HCoV-NL63 proteins, a fraction of 1 × 106 lentivirus-transduced cells from the affinity purification samples were lysed in guanidinium chloride buffer (6 M guanidinium chloride, 10 mM TCEP, 40 mM CAA, 100 mMTris-HCl pH 8）
，在95°C煮沸8分钟，并超声（10分钟 ，4°C
，30 s On，30 s折 ，高设置） 。将清除裂解物的蛋白质浓度归一化为50μg
，并在37°C下用1μglysc预先消化1小时，然后在30°C下用1μg胰蛋白酶进行1:10稀释（100 mM Tris-HCl pH 8） ，并过夜消化
。如先前所述55,56
，对具有三层C18 Empore滤光盘（3M）的Stagetips纯化了肽（3M）和随后的质谱分析。简而言之，将300 ng的纯化肽加载到50厘米的反相柱上（内径为75μm ，用reprosil-pur c18-aq1.9μm树脂（Maisch博士）堆积在室内 。使用自制柱烤箱在60°C保持柱温度
。由缓冲液A（0.1％FA）和缓冲液B（80％ACN
，0.1％FA）组成的二进制缓冲系统用于肽分离，流速为300 NL min -1。通过纳米流液色谱法直接与质谱仪（Q精度HF-X ，Thermo Fisher Scientific）直接耦合的易于NLC 1200系统（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）与质谱仪（Q精度HF-X，Thermo Fisher Scientific）耦合 。Peptides were eluted by a linear 80 min gradient from 5% to 30% buffer B (0.1% v/v FA, 80% v/v ACN), followed by a 4 min increase to 60% B, a further 4 min increase to 95% B, a 4 min plateau phase at 95% B, a 4 min decrease to 5% B and a 4 min wash phase of 5% B. To acquire MS data, the data-independent acquisition (DIA) scan mode operated由Xcalibur软件（Thermo Fisher） 被使用
。在一个完整的MS事件中进行DIA进行
，然后在一个周期中进行33 ms/ms窗口，导致周期为2.7 s。完整的MS设置包括300–1,650 m/z范围内的3×106电荷的离子目标值 ，最大注入时间为60 ms
，在M/z 200时的分辨率为120,000 。DIA前体窗口范围为300.5 m/z（第一窗的下部边界）（第一窗的下部边界）至1,649.5 m/z（1,649.5 m/z（33.33rd窗口的上限））
。MS/MS设置包括具有Xcalibur Automated的最大注入时间的前体窗口的3×106电荷的离子目标值，在m/z 200时分辨率为30,000。 　　为了生成蛋白质组文库进行DIA测量的蛋白质库 ，将所有样品的第一个重复和第四个复制物分别合并
，并通过高pH反向相位的色谱法将每个池的25μg肽分馏为24个馏分，如前所述60 。在每个分离过程中 ，每120 s每120 s移动收集管会自动串联分数。在真空离心机中总共干燥了48个级分
，重悬于缓冲液A*（0.2％三氟乙酸（TFA），2％ACN）中 ，然后使用相同的LC梯度和设置和设置和设置进行了TOP-12数据依赖性获取（DDA）扫描模式进行分析
。质谱仪由Xcalibur软件（Thermo Fisher）操作。DDA扫描在完整MS级别上的扫描设置包括300–1,650 m/z的离子目标值3×106电荷
，最大注射时间为20 ms，分辨率为20 ms ，M/z 200的分辨率为60,000 。在MS/MS 200中，目标值为105个电荷为105电荷
，最大收费为60 ms，在60毫秒的转储器中 ，且5,000个事件仅在M/Z 200中
，MS/Z 200均不在M/Z 200上
。在1.4 m/z窗口中隔离了20-S动态排除列表。通过高能量的C陷阱解离，归一化碰撞能量为27 eV ，进行了碎片 。 　　在6 、12和24 HPI收集的感染A549-ACE2细胞的冷冻裂解物（用于磷酸蛋白质组学研究的36 HPI）在冰上融化
，在95°C下煮沸5分钟，并超声处理15分钟（Branson Sonifierer）
。通过色氨酸测定估算蛋白质浓度61。为了降低和烷基化蛋白 ，将样品在45°C的TCEP（10 mM）和CAA（40 mm）下孵育5分钟 。使用胰蛋白酶（1：100 W/W
，酶/蛋白质，Sigma-Aldrich）和LYSC（1：100 W/W ，酶/蛋白质
，Wako）在37°C下消化样品过夜
。 　　为了蛋白质组分析，使用SDB-RPS Stagetips（Empore）61脱盐10μg肽材料。简而言之 ，将样品用1％TFA在异丙醇中稀释至最终体积为200μl，并加载到Stagetips上
，随后在异丙醇中用200μl的1％TFA洗涤，为200μL0.2％TFA/ 2％ACN 。用75μl的1.25％氢氧化铵（NH4OH）在80％ACN中洗脱肽 ，并使用SpeedVac离心机（Eppendorf
，Eccentator Plus）干燥
。在LC -MS/MS分析之前，将它们重悬于缓冲液A*（0.2％TFA ，2％ACN）中。在280 nm（Nanodrop 2000
，Thermo Scientific）下光学测量肽浓度，然后使用缓冲液A*进行均衡 。通过LC -MS/MS分析了一微克肽。 　　将其余样品用异丙醇中的1％TFA稀释四倍 ，并将其加载到SDB-RPS墨盒（Strata-X-C
，每3毫升3毫升，现象）上 ，并用4 mL 30％MEOH/1％TFA预取上
，并用4 mL 0.2％TFA洗涤
。在异丙醇中用4 mL 1％TFA洗涤样品两次，一次用0.2％TFA/2％ACN洗涤样品 ，并用2 mL 1.25％NH4OH/80％ACN洗脱两次。将洗脱的肽用DDH2O稀释至最终ACN浓度为35％，快速冷冻并冻干 。 　　对于磷酸肽富集
，将冻干的肽重悬于105μl的平衡缓冲液（1％TFA/80％ACN）中，并在280 nm（Nanodrop 2000 ，Thermo Scientific
，Thermo Scientific）下光学测量肽浓度，然后使用EquiLibratibration Buffer进行均衡
。AssayMap Bravo机器人（Agilent）通过启动测定AssayMap弹药术（用5μlFe3+-nta填充磷酸肽（150μg）在99％ACN中用0.1％TFA填充磷酸肽（150μg） ，然后在99％的ACN中进行平衡
，然后在平衡的掩护和pepters pothide中平衡。用1％氢氧化铵洗脱富集的磷酸肽，使用SpeedVAC蒸发20分钟 。将干肽重悬于6μL缓冲液A*中 ，并通过LC -MS/MS分析5μL
。 　　对于二肽富集
，在IAP缓冲液（50 mM MOPS，pH 7.2 ，10 mM Na2HPO4
，50 mM NaCl）中重新生成了冻干的肽，并通过色氨酸分析估算肽浓度。使用PTMSCAN泛素残留基序（K-ɛ-GG）试剂盒（细胞信号技术）富含含有肽的K-ɛ-GGG残留物 。如前所述 ，对珠子的抗体交联，随后进行了轻微的修饰
。简而言之
，将两个小瓶交联的珠子组合在一起，并平均分成16个试管（每管〜31μg抗体）。将相等的肽量（600μg）添加到交联珠中 ，并用IAP缓冲液调节体积为1 mL 。在4°C孵育1小时并轻轻搅拌后
，用冷IAP将珠洗涤两次，并用冷DDH2O洗涤5次
。此后 ，用50μl0.15％TFA洗脱肽两次。按照描述的蛋白质组分析对洗脱肽进行脱盐和干燥
，差异是，在异丙醇中使用0.2％TFA而不是1％TFA进行第一次洗涤 。将洗脱的肽重悬于9μL缓冲液A*中 ，并对4μL进行LC -MS/MS分析。 　　将样品加载到50厘米反向相的柱上（内径75μm
，挤在带有reprosil-pur C18-AQ1.9μm的Resin（Maisch Dr）中）
。使用自制柱烤箱在60°C保持柱温度。由缓冲液A（0.1％FA）和缓冲液B（80％ACN加0.1％FA）组成的二进制缓冲系统用于肽分离，流速为300 NL min -1 。通过纳米 - 流液液相色谱 ，使用了一个与质谱仪（Orbitrap Exploris 480
，Thermo Fisher Scientific）直接在线耦合的Easy-NLC 1 200系统（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）（Orbitrap Exploris 480，Thermo Fisher Scientific）
。将FAIMS设备放置在纳米电喷雾源和质谱仪之间 ，并用于测量蛋白质组和PTM-ubrary样品。喷雾电压设置为2,650 V，RF水平为40
，加热毛细血管温度为275°C 。 　　对于蛋白质组测量，我们使用了100分钟的梯度 ，从5％缓冲液B开始
，然后在80分钟内逐步增加到30％，4分钟内60％和4分钟内的95％
。缓冲液B浓度保持95％ ，持续4分钟
，在4分钟内降至5％，并在那里呆了4分钟。质谱仪以数据独立模式（DIA）运行 ，全扫描范围为350–1,650 m/z
，以200 m/z分辨率为120,000，归一化自动增益控制（AGC）目标为300％ ，最大填充时间为28 ms 。一项完整的扫描随后是22个窗口
，分辨率为15,000，归一化AGC目标为1,000％ ，最大填充时间为25 ms，在配置模式下使用正极性
。前体离子被HCD碎片（NCE 30％）。每个选定的补偿电压（CV）（-40
，-55和-70 V）都应用于顺序的调查扫描和MS/MS扫描；MS/MS CV始终与相应的调查扫描中的适当CV配对 。 　　对于磷酸肽样品，将5μl加载并用70分钟的梯度洗脱 ，从3％缓冲液B开始
，然后在40分钟内逐步增加到19％，在20分钟内41％ ，在5分钟内90％和5分钟内95％
。质谱仪以DIA模式运行
，全扫描范围为300-1,400 m/z，以200 m/z分辨率为120,000 ，最大填充时间为60 ms。一次完整的扫描随后是32个窗户
，分辨率为30,000 。归一化AGC目标和最大填充时间分别设置为使用正极性在剖面模式下，分别设置为1,000％和54 ms。前体离子被HCD碎片（NCE步骤25–27.5–30％）
。对于图书馆的生成 ，我们富含A549细胞裂解物的磷酸肽
，并使用7种不同的CV设置（-30，-40 ，-50，-50
，-60，-70 ，-70
，-80或-90 V）测量了它们。在整个分析过程中，将注意到的CV应用于Faims电极 。 　　为了分析K-ɛ-GGG肽样品 ，加载了一半的样品
。我们使用了120分钟的梯度
，从3％缓冲液B开始，随后在6分钟内逐步增加到7％ ，49分钟内20％
，39分钟内36％，10分钟内45％和4分钟内95％。缓冲液B浓度保持95％ ，持续4分钟
，在4分钟内降至5％，并在那里呆了4分钟 。质谱仪以DIA模式运行 ，全扫描范围为300–1,350 m/z，分辨率为M/z 200
，归一化AGC目标为300％，最大填充时间为20 ms
。一顿完整的扫描随后是46个窗户 ，分辨率为30,000。归一化AGC目标和最大填充时间分别设置为使用正极性在剖面模式下
，分别设置为1,000％和54 ms 。前体离子被HCD碎片（NCE 28％）
。对于K-ɛGG肽库，我们使用八个不同的CV设置（-35 ，-40
，-45，-50 ，-50
，-55，-55 ，-60
，-70或-80 V）将每个样品的第一个复制物混合在一起，并使用同一DIA方法测量它们。 　　使用标准设置和启用的标准设置（LFQ最小值计数1 ，标准化类型NONE，稳定较大的LFQ比率稳定较大的LFQ比率）
，使用标准设置和无标签量化（LFQ Min比率1，稳定较大的LFQ）使用MAXQUANT（1.6.14版）处理AP-MS实验的原始MS数据文件 。通过内置的andromeda搜索引擎63 ，对综述的人蛋白质组的前进和反向序列进行了搜索
，包括同工型（UniProtkB，2019年发行版）和C端HA标签的SARS-COV-2 ，SARS-COV和HCOV蛋白质的光谱
。 　　In-house Julia scripts (https://doi.org/10.5281/zenodo.4541090) were used to define alternative protein groups: only the peptides identified in AP–MS samples were considered for being protein group-specific, protein groups that differed by the single specific peptide or had less than 25% different specific peptides were merged to extend the set of peptides used for protein group quantitation并减少蛋白质同工型特异性相互作用的数量。 　　使用默认设置的Spectronaut版本13（Biogognosys）通过使用Human FastA文件（Uniprot
，2019.10，42 431条目）和病毒诱饵序列组合相应的分馏文件来从DDA运行中生成蛋白质组库 。使用具有默认设置的蛋白质组库分析蛋白质组直径文件 ，并禁用的交叉运行归一化。 　　Spectronaut版本14（biognosys）64用于生成库
，并使用Human FastA文件（UniprotkB，2019年版）和SARS-COV-2/SARS-COV蛋白（Uniprot ，UniProt
，Release 2020.08）分析所有DIA文件
。根据Uniprot中指定的裂解位置，将ORF1A多蛋白序列分为单独的蛋白质链。对于PTM特异性文库的生成 ，将DIA单个CV运行与实际DIA运行组合，并在丝氨酸
，苏氨酸或酪氨酸或赖氨酸处的磷酸化中磷酸化，将其添加为默认设置的可变修饰 。每个肽的最大碎片离子数量增加到25
。使用默认设置和残疾人的交叉运行归一化对蛋白质组直径进行分析。使用其各自的混合库分析了所有翻译后修改DIA文件 ，并在丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸或赖氨酸时在丝氨酸时进行磷酸化
，作为对具有Loes归一化和残疾PTM本地化过滤器的默认设置的附加变量修改 。 　　使用朱莉娅脚本（https://doi.org/10.5281/zenodo.4541090）的集合来处理洗脱组（EG） - 级别的Spectronaut报告，识别PTMS并将EG级测量分配给PTMS
。如果至少一旦检测到≥0.75的定位概率 ，例如q值≤10-3
，则考虑使用PTM。为了进一步分析给定的PTM，仅使用了≥0.5定位概率和例如Q值≤10-2的测量值 。 　　除非另有说明 ，否则使用内脚本（https://doi.org/10.5281/zenodo.4541090 and https:4541090 and https：https:/https：/https://doi.org/10.52281）
，使用R（版本3.6），Julia（版本1.5）和Python（版本3.8）进行生物信息学分析
。 　　该研究中使用了以下公共数据集：基因本体论和反应仪说明（http://download.baderlab.org/em_genesets/april_01_2019/human/uniprot/uniprot/human/human_go_go_allatheways_go_go_go_go_go_iea_iea_iea_april_patril_april_011_2011111111111111111111111111111111111111111111119GMROT.MIMTROT.CRROT.CRROT.MIMTROT.CRROT;完整的蛋白质相互作用（https://www.ebi.ac.uk/intact/ ，v2019.12）;完整的蛋白质复合物（https://www.ebi.ac.uk/complexportal/home
，v2019.12）;Corum蛋白复合物（http://mips.helmholtz-muenchen.de/corum/download/allcomplexes.xml.zip，v2018.3）;Reactome功能相互作用（https://reactome.org/download/tools/reatomefis/fisingene_020720_with_annotations.txt.zip）;人类（V2019.10） ，人-COV，SARS-COV-2和SARS-COV（V2020.08）蛋白序列：https：//uniprot.org。 　　使用内部Maxquantutils R软件包（https://doi.org/10.5281/zenodo.4536603）将Maxquant和Spectronaut输出文件导入R中 。对于所有MS数据集
，使用贝叶斯线性随机效应模型来定义条件之间蛋白质的丰度变化
。为了指定和拟合模型，我们使用了MSGLM R软件包（https://doi.org/10.5281/zenodo.4536605） ，该软件包使用RSTAN软件包（版本2.19）65来推断模型参数的后验分布。在所有模型中
，与实验条件相对应的效果具有正规的马蹄+ priors66，而批处理效应正常分布 。拉普拉斯分布用于建模MS强度的仪器误差。对于使用的每种MS仪器 ，使用该仪器的技术复制MS数据校准了异质的强度噪声模型
。这些数据还用于校准基于logit的MS数据的模型（MS仪器无法识别蛋白质在样品中预期的丰度的概率）。该模型使用非规范化的MS强度数据拟合 。而不是通过归一化来转换数据
，而是通过每个MS样品的归一化乘数缩放了推断的蛋白质丰度，以匹配该样品的预期MS强度
。这允许在拟合模型时考虑样品之间的信噪变化。由于高计算强度 ，该模型分别应用于每个蛋白质组 。对于所有模型
，在7或8个独立的链中进行了4,000次迭代（2,000个热身 + 2,000个采样）蒙特卡洛，每4个样本都收集以用于模型参数的后验分布
。为了估计两个实验条件之间蛋白质丰度变化的统计显着性 ， p值定义为与从第二条件中绘制的随机样品相比
，第一个条件后验分布的随机样品的概率要小（或更大）。应用了无多种假设检验校正，因为这是通过模型先验的选择来处理的 。 　　统计模型直接应用于蛋白质组特异性LC峰的MS1强度（证据
。最大输出表）。在R GLM公式语言中 ，该模型可以指定为 　　与全蛋白质组样品相比，APM效应模拟了APMS数据中强度的平均变化
，则诱饵是SARS-COV和SARS-COV和SARS-COV和SARS-COV-2和BAIT的同源蛋白质中蛋白质的平均富集，以及诱饵：病毒：病毒对应于蛋白质富集的病毒特异性变化 。MS1PEAK是给定峰的强度与总蛋白质丰度之间的对数比（峰是由其肽序列 ，PTM和电荷定义的；假定峰值比不依赖于实验条件67）
，而MSBATCH对蛋白质强度的批次特异性变化表示
。APM，诱饵和诱饵：病毒效应用于重建AP-MS样品中蛋白质的无批次效应丰度。 　　该建模提供了每个AP实验中每种蛋白质的富集估计值 。特定的AP -MS相互作用必须通过两个测试。在第一次测试中 ，将候选蛋白在给定的诱饵AP中的富集与背景进行了比较
，该背景是动态定义的，每次相互作用都包含来自所有其他诱饵的数据 ，在这些诱饵中
，候选者的丰度在50-90％的百分位范围内（将蛋白质从后台不包括蛋白质不包括蛋白质中的最高10％的诱因，可以由少数诱饵在该网络中共享
。非目标控制和高斯荧光素酶诱饵总是保存在背景中。同样 ，为了滤除非常高诱饵蛋白表达的任何潜在副作用
，ORF3同源物始终存在于M相互作用的背景中，反之亦然 。为了排除批处理效应的影响 ，应用了第二个测试
。它的定义与第一个类似，但是背景被限制在同一批次的诱饵上
，并使用了40-80％的百分位范围。在这两种测试中，蛋白质必须在背景上富集四倍（对于高度表达的诱饵：16倍：ORF3 ，M
，NSP13，NSP5 ，NSP5
，NSP6，ORF3A ，ORF7B
，ORF7B，ORF8B和HCOV-229E ORF4A） ，使用p Value≤10-3 。 　　此外
，我们排除了蛋白质，即在病毒蛋白表达数据中显示上调 ，并且它们在AP -MS数据中的富集比观察到的上调效应强的16倍
。最后，为了排除通过MS顺序分析的样品之间的材料的结转
，我们删除了推定的相互作用者，这些相互作用者在上述诱饵的样品中或之前的样品中也以较高的水平富集。 　　为了分析同源病毒蛋白之间的相互作用特异性 ，我们估计了相互作用富集差异的重要性（通过共享相互作用者的富集之间的平均差异来校正以调整诱饵表达变化） 。与p值≤10-3的同源物相比
，必须富集特定的相互作用
。 　　病毒蛋白过表达数据集的统计模型与AP-MS数据相似，只是使用了Spectronaut提供的蛋白质水平强度。蛋白质强度的PCA分析已经确定 ，第二个主要成分与样品之间的批处理依赖性变化有关 。为了排除其影响
，将此主要成分添加到实验设计矩阵中，作为附加批处理效应
。 　　与AP -MS数据一样 ，两项统计检验用于识别显着调节的蛋白质（补充表3中的“ IS_CHANGE ”列）。首先
，与背景相比，给定病毒蛋白过表达后 ，蛋白质丰度的中值log2倍变化的绝对值必须高于1.0
，p值≤10-3 。为每个分析的蛋白质分别定义了背景。它由实验组成，其中给定蛋白的丰度在所有测量样品的20-80％百分位范围内
。其次 ，必须针对特定于批处理的背景（与全局背景相似，但仅使用同一批次的样品）
，必须对蛋白质进行显着调节（相同的中位数变化和p值阈值）。 　　应用了另一个严格的标准，以选择最重要的更改（补充表3中的“ IS_TOP_CHANGE
”列；扩展数据图1i） 。 　　对于每种蛋白质 ，我们将诱饵诱导的变化分类为：“高” |中间log2变化|≥1和p值≤10-10在背景和批次比较中；“媒介 ”如果10-10 <p值≤10-4
，则需要相同的折叠要求；如果10-4 <p值≤10-2，则具有相同的折叠要求
。所有其他变化都不显着。 　　然后 ，我们要求“共享”受调节的蛋白质应完全具有一对SARS-COV-2和SARS-COV高或中等重要的同源性诱饵
，并具有上调或下调的变化，并且没有其他类型的诱饵 。 　　我们进一步将“ SARS-COV-2特异性
”或“ SARS-COV特异性”蛋白质定义为具有一个高度变化的蛋白质 ，并且没有其他相同符号的重大变化
。对于“特定 ”命中
，我们还要求将高显着诱饵与其同源物进行比较。≥1和p值≤10-3 。当缺少同源诱饵（SARS-COV-2 NSP1，SARS-COV ORF8A和SARS-COV ORF8B）时 ，我们需要在比较高显着变化与背景的中间log2折叠变化|时需要该
。≥1.5。 　　导入最大的蛋白质网络已进口并准备在Cytoscape v.3.8.168中发布 。 　　与AP-MS DDA数据相似
，将线性贝叶斯模型应用于EG级强度
。为了建模蛋白质强度，使用了以下线性模型（在r符号中）： 　　其中（Ti）效应对应于感染后Ti-1和Ti之间发生的模拟感染样品的蛋白质丰度变化 ，并将其应用于Ti从Ti开始的所有时间点的建模强度；感染：（Ti）之后（Ti = 6
、12、24）是Ti-1和Ti之间发生的SARS-COV-2和SARS-COV感染的共同作用；COV2：（Ti）之后是Ti-1和Ti HPI中的病毒特异性作用，它被添加到SARS-COV-2感染的样品的对数强度中
，并从SARS-COV的强度中减去。例如，测量的对数强度的洗脱组特异性转移 。 　　与模拟感染相比 ，使用了高于0.25的条件与相应的未调整的p值≤10-3之间的中值log2折叠变化与相应的未调整的p值≤10-3之间的显着变化。我们还要求将蛋白质组至少在至少一个比较条件下的重复中进行定量
。另外
，如果仅对于一种病毒（例如，SARS-COV-2） ，仅实现了较严格的状况（|中位数log2折叠变化|≥0.125
，p值≤10-2）才得以实现，但这种变化在其他病毒（SARS-COV）（SARS-COV）的感染中是显着的 ，并且对病毒之间的差异并不重大
，则观察到了重大变化。 　　分别分析了来自单双重和三次修饰的肽的数据，对于给定的PTM ，报告了最重要的结果 。 　　用与蛋白质组SARS-COV和SARS-COV-2感染数据相同的贝叶斯线性模型分析数据
。除了强度归一化之外
，对于每个重复样本，调整了实验设计矩阵中效果的尺度 ，因此平均而言，复制的对数折叠变化之间的相关性为1：1。与蛋白质组分析相同的逻辑被应用以识别重大变化
，但是中位数折叠的变化必须大于0.5，或者对于严格测试较小的测试而言 ，0.25 。我们还要求将PTM肽在至少两个比较条件中的至少两个重复中进行定量
。为了忽略蛋白质组级调节引起的PTM位点强度的变化
，如果蛋白质和PTM位点的方向相同，并且其中值log2折叠之间的差异较小 ，则我们排除了显着调节蛋白质上的PTM位点。通过Ingenuity途径分析软件（Qiagen; https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenity-pathway-analysis）进一步分析磷酸蛋白质组学数据 。 　　为了分析转录组数据
，Gencode基因注释V28和人参考基因组GRCH38源自Gencode HomePage（EMBL-EBI）
。病毒基因组源自GenBank（SARS-COV-2-LR824570.1和SARS-COV-AY291315.1）。DropSeq工具V1.12用于将原始测序数据映射到参考基因组 。将结果的UMI过滤计数矩阵导入R v3.4.4
。计算了原始数据的CPM（百万）值，并从数据集中删除了平均CPM值小于1的基因。使用协变量感染状态（模拟 ，SARS-COV
，SARS-COV-2）和时间点的虚拟变量用于对LIMMA（v3.46.0）内的数据进行建模69 。 　　用VOOM方法69转换数据，然后进行分位数归一化。通过计算每个宿主基因的调节t统计量和p值 ，在各个时间点之间在各个时间点进行差异测试
。如果错误发现率调整后的P值低于0.05
，则认为一个基因受到显着调节。 　　我们使用了人类蛋白质（版本2020.10）70的基因本体论，Reactome和其他富集图基因集（版本2020.10）以及完整复杂门户（版本2019.11）71和Corum（版本2019）72的蛋白质复合物 。PhosphositePlus（版本2020.08）用于已知的激酶 - 底物和调节位点注释 ，Perseus（版本1.6.14.0）73用于注释已知的激酶基序
。为了进行转录因子富集分析（扩展数据图2E），将显着调节的成绩单提交给基于CHEA3 Web的应用程序74
，并使用了转录因子 - 目标基因关联的编码数据75。 　　为了找到描述数据集中多个实验的独特和共享特征的注释的非冗余收集（图1D，扩展数据图2L ，M）
，我们使用了内部Julia软件包OPTENRICHEDSETCOVER.JL（https：//doi./doi.org/10.5281/zenodo.455365656596），以下简注释术语的集合在单个实验中具有重要的丰富性和最小成对重叠 。 　　通过要求注释项必须在至少一个实验或比较中指定的未经调整的Fisher精确的测试P值截止值必须具有重要意义（在相应的丰富分析的图传说中指示了特定的截止值）
。 　　用Vegalite.jl软件包（https://github.com/queryverse/queryverse/vegalite.jl）完成对角线分裂热图的产生。 　　为了匹配SARS-COV-2和SARS-COV的PTM ，使用BioAlignments对齐蛋白质序列 。JlJulia套餐（v.2.0; https：//https：//github.com/biojulia/bioalignments.jl）使用needleman-wunsch algorithm使用BlbloSum80 and-andription Matrix
，并使用BLOSTIRTION MADRIX，以及和扩展
。 　　对于细胞蛋白 ，我们要求在Q值≤10-3观察到病毒磷酸化或泛素化位点
，并且定位概率≥0.75。对于置信度较低的PTM（Q值≤10-2和定位概率≥0.5），我们要求在其他病毒的直系同源蛋白的匹配位置上观察到同一位点 。 　　要系统地检测功能相互作用 ，这可能会将每个病毒蛋白（Interactome数据集）的细胞靶标与下游的细胞靶标与蛋白质组水平（formationome数据集）所诱导的下游变化
，我们已经使用了基于网络扩散的层次hoticalhotnet方法36在Julia julia package hireficalhotalarchicalhotnetnet.jlnet.jlnet.jlnet.jlnet.jlnet.jlnet.jl.jlemarchicalhotnet方法36（https://doi.org/10.5281/zenodo.4536590）
。具体而言，对于重新启动的网络扩散 ，我们使用了comploMeFi网络（版本2019）35个细胞功能相互作用，逆转了功能相互作用的方向（例如
，取代激酶→与底物→激酶的底物相互作用）。在诱饵过表达时具有显着丰度变化的蛋白质（|中值（log2折叠变化）|≥0.25，p≤10-2在与对照组的比较和与同一批次的诱饵的比较中 ，都用作信号扩散源与重量设置为重量的信号源
，否则节点权重为零 。边缘GI→GJ的重量设置为Wi，J = 1+WJ。正如原始出版物中建议的那样 ，重新启动概率设置为0.4
，以便随机步行停留在节点的直接社区的概率与访问更遥远的节点的概率相同
。为了找到由加权图的强连接组件（SCC）的最佳切割树的最佳切割阈值，与信号扩散的固定分布相对应 ，并确认预测的功能连接的相关性
，将相同的步骤应用于1,000个随机置于REYNA等级的随机置置。学位） 。由于在任何阈值t上切开SCC的树（仅保持重量高于t的边缘）并将每个产生的SCC折叠成单个节点会产生SCC之间的定向无环形图，因此它允许从“源
”节点上有效地枚举路径的有效枚举
。 （蛋白质被病毒蛋白表达用顶点重量W ，W≥1.5的蛋白质​​扰动）（病毒蛋白的相互作用者）。在每个阈值t中
，从源到下沉节点的路径长度的平均倒数计算为： 　　如果nsource是源的数量，则NSINK是接收器的数量 ，LSCC（p）是从源到源源的给定路径P通过的SCC数量，并且总和是从源到接收器的所有路径 。度量从1个（同一SCC中的所有来源和下沉）变为0（源和下沉之间无限或无限长的路径）
。对于生成扩散网络
，我们使用的是最大化真实数据和第三个四分位数之间的TOPT阈值，用于随机变为数据。 　　在生成的SCC网络中 ，边缘的方向恢复了后退
，结果使用内置julia脚本（https://doi.org/10.5281/zenodo.4541090）导出为GraphMl文件 。每个病毒诱饵的网络目录可作为补充数据1
。 　　为了评估边缘在所得网络中的重要性，我们计算了边缘gi→gj的p值 ，因为基于置换数据的给定基因之间的过渡概率概率高于基于真实数据的过渡概率： 　　该p值存储为GraphMl输出的“ POR_PERM_PERM_WALKWEALT_GREATER”边缘属性。通过网络扩散预测的特定子网（图4b – d）被过滤以p≤0.05的边缘 。 　　当Gi→GJ连接不存在于ReactOMEFI网络中
，以恢复连接GI和GJ的潜在短途径时，ReactOMEFI被搜索中的中间GK节点 ，以便在ReactOMEFI中存在边缘GI→GK和GK→GK→GK→GJ
。这些短途径的列表作为GraphMl输出中的“流道 ”边缘属性提供。 　　使用YED（V.3.20; https：//www.yworks.com）准备网络扩散的GraphMl输出 。 　　本研究生成的数据与其他公开可用数据集之间的交集是使用各自补充表中的信息完成的。在研究中使用多种病毒时
，仅包括与SARS-COV和SARS-COV-2的比较
。对于时间分辨的数据，所有时间点最高为24 hpi。该数据集覆盖范围定义为用于蛋白质组学研究的不同蛋白质基团的数量和用于转录组学研究的基因 。根据原始研究中指定的标准过滤自信的互动或重要法规
。当本研究和外部数据都很重要并显示出相同的趋势时 ，它被认为是“确认
”的。 　　如上所述（Qiagen）
，从SARS-COV和SARS-COV-2感染的A549-ACE2细胞中分离RNA 。使用GDNA Eraser（Takara）使用Primescript RT进行五百个纳米图总RNA进行逆转录
。用于相对的转录定量powerup sybr绿色（Applied Biosystems）。可以根据要求提供底漆序列 。 　　将HEK293T细胞用编码单个HA标记的病毒蛋白的PWPI质粒转染，单独或与PTO-SII-HA表达宿主感兴趣的因子一起转染
。转染后48小时 ，将细胞在PBS中洗涤，在液氮中闪烁
，并保持在-80°C，直到进一步加工。如前所述55,56进行了共​​免疫沉淀实验 。简而言之 ，将细胞裂解在裂解缓冲液中（50 mm Tris-HCl pH 7.5
，100 mm NaCl，1.5 mm MgCl2 ，0.2％（v/v）NP-40
，5％（v/v）甘油，完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche） ，Roche（Roche）
，0.5％（V/V/V/V）750 U-1 Smonse（V/V），40 case（v/v在30秒内 ，较低的设置；将HA或链霉素珠添加到清除的裂解物中
，并在恒定旋转下在4°C下在4°C下孵育3小时
。将珠在裂解缓冲液中洗涤六次，并重悬于1×SDS样品缓冲液62.5 mm Tris-HCl pH 6.8 、2％SDS ，10％甘油，50 mM DTT
，0.01％Bromophenol Blue）中。在95°C下煮沸5分钟后，将输入裂解物的一部分和洗脱装在Nupage Novex 4–12％BIS-Tris（Invitrogen）上 ，并使用Amersham Protran protran硝酸溶剂纤维膜进一步提交给蛋白质印迹 。成像是通过HRP发光（ECL
，Perkin Elmer）进行的。 　　SARS-COV-2感染了A549-ACE2细胞裂解液（10分钟，4°C ，30 s ON
，30 s左右，低设置； Bioruptors ，bioruptor
，diacgodode）
。根据补充了具有离子洗涤剂兼容试剂的Pierce660测定法，对蛋白质浓度进行了调整。在95°C煮沸5分钟 ，并以最大速度进行短暂离心后
，将样品加载到Nupage Novex 4–12％BIS-Tris（Invitrogen）上，并将其吸入0.22μmAmersham阳极硝基硝基纤维素膜（Merck） 。根据制造商的建议 ，进行了初级和二抗染色
。成像是使用HRP发光使用FEMTO试剂盒（Thermofischer Scientific）或Western Lightning PlusECL试剂盒（Perkin Elmer）进行的。 　　SARS-COV-2（PDB：6YUN）和SARS-COV（PDB：2CJR）的N CTD二聚体通过将超过111个残基（从位置253/254到位置到位置364/365）通过将SARS-COV-2/SARS-cov Numbers extimente the Offactimementa用作工具匹配器76，从而将α-碳底骨架与111个残基相位（从位置253/254到位置364/365） 。使用PyMol软件（https://pymol.org）对泛素化位点进行视觉检查和映射
。通过使用PyMol78中实现的PYTMS插件在Ser310/311上的磷酸化模拟。通过使用PDBEPISA Server79
，在非磷酸化和磷酸化的SARS-COV-2和SARS-COV N CTD之间进行了比较分析，链间残基接触 ，二聚体界面区域
，自由能和复杂稳定性 。通过使用CHARMM-GUI服务器上的PBEQ求解器工具来计算天然和翻译后修饰的N CTD的Poisson – Boltzmann静电表面电位，通过保留现有的氢键80来计算
。使用Pymol软件产生分子图形描述。 　　在这项研究中使用了以下报告基因结构：pisre-luc购自EF1-α-REN ，从E.Gürlevik（胃肠病学
，肝病学和内分泌学系，德国汉诺威医学院） ，德国汉诺威医学院
，PCAGGS-FLAG-rig-I 。先前描述了PIRF1-GAS-FF-LUC，PWPI-SMN1-FLAG和PWPI-NS5（ZIKV）-ha先前描述了56,81
。 　　对于报告基因测定 ，将HEK293-R1细胞铺在转染前24小时的24孔板中。使用聚乙基胺（PEI
，polysciences）将萤火虫报告基因和肾转染对照与表达病毒蛋白的质粒一起转染，以进行未处理和处理的条件 。在18小时 ，用相应的诱导剂刺激细胞8小时，并收集在被动裂解缓冲液（Promega）中。根据制造商的指示
，在微孔板读取器（TECAN）中，使用双荧光素酶 - 重复蛋白酶测定法（Promega）测量萤火虫和肾荧光素酶的发光
。 　　通过使用293T细胞在小鼠MX1启动子（MX1-LUC报告基细胞）的控制下 ，使用293T细胞稳定表达萤火虫荧光素酶基因82来测量细胞上清液中IFN-α和IFN-β的总量。简而言之
，将HEK293-R1细胞接种，用PCAGGS-FLAG-RIG-I和病毒蛋白构建体转染 ，并如上所述刺激 。在8小时内收集细胞上清液
。将MX1-LUC报告基细胞在一式三份中播种到96孔板中
，并在24小时后用上清液处理。孵育后16小时，将细胞在被动裂解缓冲液（Promega）中裂解 ，并用微板读取器（Tecan）测量发光 。测定灵敏度由标准曲线确定
。 　　在感染前一天
，在DMEM培养基（10％FCS，100μgml-1链霉素 ，100 IU ML-1 Penicillin）中
，将A549-ACE2细胞接种到96孔板中。感染前六个小时或在感染时，将培养基替换为100μL的DMEM培养基 ，其中含有感兴趣的化合物或DMSO作为对照 。通过在每个孔中添加10μLSARS-COV-2-GFP（MOI为3）来进行感染，并将板放入Incucyte S3 Live细胞分析系统（ESSEN BIOSCIENCE）中
，在其中每4小时捕获一次模拟（相位通道）和感染（GFP和相位通道）细胞的整个良好实时图像（GFP和相位通道）
。细胞活力（模拟）和病毒生长（模拟和感染）被评估为使用Incucyte S3软件（Essen Bioscience; Essen Bioscience; Essen Bioscience; 2019b Rev2）分别通过孔（相位区域）和通过细胞汇合（GFP区域/相面积）标准化的细胞汇合。 　　为了比较对SARS-COV和SARS-COV-2的抗病毒治疗活性的比较分析，如前所述 ，将A549-ACE2细胞接种在24孔板中 。用含有感兴趣的化合物或DMSO化合物作为对照的0.5 mL DMEM培养基进行治疗6小时
，并用SARS-COV-FRANKFURT-1或SARS-COV-COV-2-MUC-IMB-1（MOI为1）感染24小时
。如前所述，收集总细胞RNA并通过RT -QPCR分析。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。