人类结肠和直肠癌的综合分子表征

　　通过不同平台分析肿瘤和正常对。补充表1显示了每个平台分析的样品的特定数量 。 　　为了定义突变谱 ，我们在224个肿瘤和正常对上进行了外显子组捕获DNA测序（所有突变均在补充表2中列出）
。测序达到了至少80％的目标外显子的20倍覆盖率。样品中的体细胞突变率差异很大 。有些有突变率的 <1 per 106 bases, whereas a few had mutations rates of >每106个100
。我们将病例分开（84％）
，突变率为 <8.24 per 106 (median number of non-silent mutations, 58) and those with mutation rates of >每106个（总突变的中位数，728） ，我们将其指定为超浮装（图1）。 　　为了评估截然不同的突变率的基础
，我们评估了DNA不匹配途径的MSI7和突变8,9,10基因MLH1，MLH3 ，MSH2，MSH2
，MSH3，MSH3 ，MSH6
，MSH6和PMS2 。在具有完整数据集的30个超沉积肿瘤中，有23个（77％）具有高水平的MSI（MSI-H）。该组中包括19个具有MLH1甲基化的肿瘤 ，其中17个具有CIMP
。相比之下
，其余七个高压肿瘤，包括六种突变速率最高的肿瘤 ，缺乏MSI-H
，CIMP或MLH1甲基化，但通常在一个或多个不匹配的治疗基因或POLε像差中很少见到在非高温性肿瘤中很少见到的POLε像差（图1）。 　　总体而言 ，我们确定了32个在高水不平和非高温癌症中的32个细胞突变基因（由mutsig11和手动策划定义）（图1B） 。去除非表达基因后
，分别超过和非高温癌中有15和17个（图1B；有关完整列表；请参见补充表3）
。在非高温肿瘤中，八个最常见的基因是APC ，TP53，KRAS
，PIK3CA，FBXW7 ，SMAD4
，TCF7L2和NRA。如预期的那样，突变的KRAS和NRA基因通常具有致癌密码子12和13或密码子61突变 ，而其余基因则具有灭活突变 。CTNNB1
，SMAD2，FAM123B（也称为WTX）和SOX9也经常突变
。FAM123B是Wnt Signalling12的X连锁负调节器 ，其几乎所有突变都是功能丧失。Sox9中的突变是一种对肠道干细胞nICHE13,14中细胞分化重要的基因
，以前与人类癌症没有相关，但是在非杂化CRC中的所有九个突变等位基因均均为frameshift或毫无意义的突变 。肿瘤 - 抑制基因ATM和ARID1A也具有不成比例的翻新或废话突变
。最近在CRC和许多其他癌症中报道了ARID1A突变15,16。 　　在超沉积的肿瘤中 ，ACVR2A
，APC，TGFBR2 ，MSH3，MSH6
，SH6，SLC9A9和TCF7L2是突变的频繁靶标（图1B） ，主要是BRAF（V600E）突变 。但是
，在非高温癌症中经常突变的两个基因在高压肿瘤中突变的频率明显较小：TP53（60 vs 20％，p <0.0001）和APC（81％对51％对51％ ，P = 0.0023； p = 0.0023; tere Cyst fisher的确切测试）
。包括TGFBR2在内的其他基因在高空癌症中反复突变
，但在非杂种样品中却没有。这些发现表明，超沉积和非高温肿瘤通过不同的遗传事件序列进行 。 　　如预期的那样 ，MLH1沉默和MSI-H的高压肿瘤在突变曲线上显示出其他差异。当我们在其编码序列中特别检查了具有长的单核苷酸重复序列的28个基因时
，我们发现，在没有MLH1沉默的无MLH1沉默和50倍的情况下 ，移交突变的速率比未甲基化的肿瘤高3.6倍（补充表2）
。 　　如上所述
，结肠和直肠肿瘤患者的治疗方式不同。17，流行病学也突出了两17之间的差异 。对MSI状态 ，体拷贝数变化（SCNA），CIMP状态和132个结肠和62个直肠肿瘤的基因表达谱的初步整合分析
，使我们能够检查两个位置中肿瘤之间可能的生物学差异
。然而，在非高肥大的肿瘤中 ，拷贝数
，cimp，mRNA和miRNA的总体模式在结肠和直肠癌之间是无法区分的（图2）。在此结果的基础上 ，我们将两者合并为所有后续分析 。 　　236个结直肠肿瘤的启动子DNA甲基化谱的无监督聚类鉴定出四个亚组（补充图1和补充方法）
。如前所述
，有两个簇含有甲基化速率升高的肿瘤，并被归类为CIMP高和CIMP低的肿瘤 ，如前所述18。这两个非CIPP簇主要来自非杂种并衍生自不同解剖位置的肿瘤 。mRNA表达谱将大肠肿瘤分离为三个不同的簇（补充图2）
。一种与CIMP-高肿瘤重叠（P = 3×10-12）
，并富含过度肿瘤，而其他两个簇与甲基化数据中的任何组都不相对。通过无监督聚类对miRNA表达的分析（补充图3）确定直肠癌和非甲基化结肠癌之间没有明显的区别 。 　　总共为Affymetrix SNP 6.0阵列的SCNA分类了257个肿瘤
。在这些肿瘤中 ，还通过低深度覆盖（低通）全基因组测序分析了97个。如预期的那样
，超充血的肿瘤的SCNA较少（图2） 。在微卫星稳定和未稳定的高透明肿瘤之间没有发现差异（补充图4）。我们使用GISTE算法19来识别局灶性改变的可能基因靶标
。有几种以前定义明确的臂级变化，包括1q ，7p和Q，8p和Q
，12q，13q ，13q
，19q和20p和Q（参考文献6）的收益。（补充图4和补充表4） 。在66％的肿瘤中，显着删除的染色体组为18p和Q（包括SMAD4） ，17p和Q（包括TP53）为56％
。其他显着删除的染色体臂包括1p
，4q，5q ，8p
，14q，15q ，20p和22q。 　　我们确定了28个复发性缺失峰（补充图4和补充表4）
，包括基因，rbfox1和WWOX的基因 ，具有大型基因组足迹，位于基因组潜在脆弱部位
，近于二倍体型高肿瘤中 。其他局灶性缺失涉及肿瘤抑制基因，例如SMAD4 ，APC
，PTEN和SMAD3
。10p25.2的显着局灶性缺失跨越了四个基因，包括TCF7L2 ，在我们的数据集中也经常突变。在3％的CRC中发现了相邻基因VTI1A和TCF7L2之间相邻基因之间的基因融合
，这对于带有转运的CRC细胞的存活是必需的 。 　　有17个明显的局灶性扩增区域（补充表4）
。其中一些被叠加在巨大的染色体臂上，并在肽酶编码基因USP12附近和距CRC候选癌基因CDK8远端500 kb的峰值峰为13q12.13中。邻近的峰在2012年第13季度；在13q22.1中包含KLF5的峰;和HNF4A附近的2013年第20季度的峰值 。8号染色体上的峰包括8p12（其中包含与FGFR1相邻的组蛋白甲基转移酶编码基因WHSC1L1）和8q24（其中包含MYC）
。在4％的肿瘤中发现的17q21.1的扩增子包含七个基因 ，包括酪氨酸激酶ERBB2。在结肠
，乳腺癌和胃食管肿瘤以及带有这些扩增的乳腺癌和胃癌中已经描述了ERBB2的扩增，已用抗-ERBB2抗体Trastuzumab20,21,22有效地治疗了这些扩增的乳房和胃癌 。 　　在7％的肿瘤中发现的最常见的局灶性放大之一是染色体ARM 11P15.5的100–150-Kb区域的增益。它包含编码胰岛素（INS） ，胰岛素样生长因子2（IGF2）和酪氨酸羟化酶（TH）以及miR-483的基因
，该基因嵌入了IGF2中（图3A）
。我们发现IGF2和miR-483的表达升高，而不是INS和TH（图3B ，C）。与扩增区域相邻的紧邻是ASCL2，这是指定肠道干细胞Fate23的转录因子 。尽管ASCL2被牵涉到CRC23,24,25中扩增的目标
，但它始终超出放大区域，并且其表达与副本数量的变化无关
。这些观察结果表明 ，IGF2和miR-483是11p15.5扩增的候选功能靶标。通过失去印迹的IGF2过表达与促进CRC26,27有关 。miR-483也可能在CRC发病机理中起作用28
。 　　一部分没有IGF2扩增的肿瘤（15％）也具有更高水平的IGF2基因表达（高达100倍）
，这种作用不归因于IGF2启动子的甲基化变化。为了评估IGF2扩增/过表达的上下文，我们使用备忘录方法系统地搜索了相互排斥的基因组事件 。我们发现IGF2过表达的几乎排他性（校正P <0.01）的模式已知可激活PI3K途径的基因组事件（PIK3CA和PIK3R1的突变或PTEN的删除/突变；图3C和补充表5）
。IRS2基因编码将IGF1R（IGF2的受体）与PI3K连接的蛋白质的基因在CRC中经常获得的染色体上。IRS2表达最高的病例不包括IGF2过表达的病例（P = 0.04） ，并且在PI3K途径中也缺乏突变（P = 0.0001；图3C） 。这些结果强烈表明
，CRC中的IGF2 – IGF1R -IRS2轴向PI3K信号，这意味着该途径的治疗靶向可以阻止患者该子集中的PI3K活性
。 　　为了鉴定新的染色体易位 ，我们对具有匹配的正常样品的97个肿瘤进行了低通
，配对的全基因组测序。在每种情况下，我们都达到了3-4倍的序列覆盖率 ，相应的物理覆盖率为7.5-10倍 。尽管基因组覆盖范围较低
，但我们还是检测到250个候选胞胞体易位事件（范围为每个肿瘤0-10）。在这些事件中，212在一个基因间区域中有一个或两个断点 ，而其余的38个在假定融合事件中有两个基因的并列编码区域，其中18个预计将有18个代码为框架内事件（补充表6）
。我们发现了三个单独的病例
，其中11号染色体上NAV2基因的前两个外显子与2号染色体上TCF7L1的3'编码部分相结合（补充图5）。TCF7L1编码TCF3，TCF3是TCF/LEF类别的转录因子的成员 ，它们用核β-catenin异二聚二聚体
，以实现β-catenin介导的转录调控 。有趣的是，在所有三种情况下 ，NAV2-TCF7L1融合蛋白的预测结构都缺乏TCF3β-catenin结合结构域
。该易位类似于CRC中确定的另一种复发易位
，其中融合了VTI1A的氨基末端与TCF4连接在一起，TCF7L2编码TCF7L2 ，TCF7L2是TCF7L1的同源物
，该同源物在非Hypermutated tumours4中被删除或突变。我们还观察到涉及位于22号染色体上的TTC28的21例易位病例（补充表6） 。在所有情况下，融合预测TTC28的失活 ，TTC28被确定为p53的靶标和肿瘤细胞生长的抑制剂30
。通过获得PCR产物或在某些情况下对结片片段进行测序（补充图5）
，在19（58％）基因易位中的11个（58％）易位。 　　在195个肿瘤中对突变，拷贝数和mRNA表达变化的综合分析具有完整的数据 ，使我们对某些定义明确的途径的理解充实了 。我们通过高磨损状态对样品进行了分组，并确定了Wnt
，MAPK，PI3K ，TGF-β和p53途径中的复发变化（图4
，补充图6和补充表1）
。 　　我们发现，在所有肿瘤的93％中 ，Wnt信号通路发生了变化
，包括APC的双重失活（补充表7）或80％病例中CTNNB1的激活突变。TCF7L2中的Sox9，突变和缺失也存在突变 ，以及DKK家族成员和Axin2
，FBXW7（补充图7），ARID1A和FAM123B（后者是Wnt-β-catenin信号的负调节剂 ，对Wilms'Tumour’Tumour’Tumours’Tumours’Tumours’Tumours'tumouring12） 。以前在CRC32中已经描述了FAM123B中的一些突变
。已建议SOX9在癌症中起作用
，但以前没有任何突变。在100倍正常水平的某些情况下，在17％的样品中 ，Wnt受体毛躁（FZD10）过表达 。总的来说，我们发现了16个不同的Wnt途径基因
，证实了该途径在CRC中的重要性。有趣的是，其中许多改变是在含有APC突变的肿瘤中发现的 ，这表明影响Wnt信号通路的多个病变赋予了选择性优势
。 　　PI3K和RAS -MAPK途径的遗传改变在CRC中很常见。除了IGF2和IRS2的过表达外
，我们还发现了PIK3R1和PIK3CA中的互斥突变，以及PTEN中的2％ ，15％和4％的非高透明肿瘤的缺失 。我们发现
，55％的非毛发肿瘤在KRAS，NRAS或BRAF中具有改变 ，具有相互排他性的显着模式（补充图6和补充表1）
。由于这种突变的转化相关性
，我们还评估了红细胞性白血病病毒性癌基因同源物（ERBB）家族的突变。四个ERBB家族基因之一中的一个突变或扩增存在于165个（13％）的非杂种中的22例（13％）中，其中30例（53％）（53％）过度过多的病例中有16例 。其中一些突变在宇宙数据库33中列出 ，这表明功能作用
。有趣的是
，在四个和两个非造型病例中发现了复发性ERBB2（V842I）和ERBB3（V104M）突变。应评估ERBB2的突变和局灶性扩增（补充图6）作为对靶向这些受体的反应的预测指标 。我们观察到涉及肿瘤三分之一的RAS和PI3K途径的变化的同时发生（图4； P = 0.039，Fisher的精确测试）
。这些结果表明 ，可能需要同时抑制RAS和PI3K途径以实现治疗益处。 　　已知TGF-β信号传导途径在CRC和其他Cancers34中受到解析 。我们在TGFBR1，TGFBR2
，ACVR2A，ACVR1B ，SMAD2
，SMAD3和SMAD4中发现了基因组改变，其中27％的非氧化肿瘤和87％的高渗透肿瘤
。我们还评估了p53途径 ，发现TP53的变化在59％的非造型病例中（主要是双乳液；补充表8）
，而ATM的变化是7％的激酶，一种激酶会磷酸化和激活DNA损伤后p53的激酶。这两个基因的改变显示了相互排他性的趋势（p = 0.016）（图4 ，补充图6和补充表1） 。 　　我们使用范式软件平台35集成了拷贝数
，基因表达，甲基化和途径数据。分析显示了CRC的许多新特征（图5A）
。例如 ，尽管解剖学起源或突变水平有多样性
，但这些肿瘤中几乎有100％的MYC转录靶标有变化，均由MYC促进的肿瘤和MYC抑制的靶标有变化。这些发现与遗传改变得出的模式一致（图4） ，并提出了MYC在CRC中的重要作用 。该分析还确定了在所有肿瘤样本中都发生了变化的几个基因网络，并且在超沉积和非高透明样品中具有差异变化的基因网络（补充表7
，有关癌症基因组大图表出版物网页的补充数据）
。 　　由于本研究中使用的大多数肿瘤都是从前瞻性收集中得出的，因此无法获得生存数据。但是 ，在肿瘤期
，淋巴结状态，远处转移和血管侵袭时 ，肿瘤可以归类为侵略性或非侵入性 。我们发现许多与肿瘤侵袭性相关的分子特征
，其中的子集如图5B所示
。它们包括特定的局灶性扩增和缺失，以及基因表达水平的改变 ，包括SCN5A（参考文献36）
，这是据报道的结肠癌入侵调节剂（有关完整列表，请参见补充表10和11）。在miRNA和特定体细胞突变的改变（APC ，TP53
，PIK3CA，BRAF和FBXW7；补充图8B）中 ，还观察到与肿瘤侵袭性的关联 。FBXW7（38例）和远处转移（32例）中的突变（p = 0.0019）
。有趣的是，许多基因组区域具有多种分子关联
，肿瘤侵袭性表现为临床相关的基因组热点。其中的例子是区域20q13.12，其中包括局灶性扩增和与肿瘤攻击相关的多个基因 ，而区域22q12.3（参考文献37）（补充图8和9） 。