p53损失后有序和确定性的癌症基因组进化

　　p48cre; lsl-krasg12d; p53flox/wt; chc; rosa26-caggs-caggs-lsl-rtta-rtta-ires-mkate2（rik）胚胎茎（ES）细胞源自胚胎第3.5（e3.5）胚胎的胚胎天blyocysts，从超过3-6-6-6-6-6-6-6-6-eek-p4-p4-eek-p4-p48crox;如前所述 ，有6-10周大的雄性LSL-Krasg12d/+; CHC/CHC; RIK/RIK小鼠如前所述31。这种繁殖方案导致CHC和p53flox基因座的分离在小鼠染色体的单独等位基因11 。p48cre; lsl-krasg12d; p53lsl-r172h/wt; p48cre; rik ES细胞; rik ES细胞均与E3.5甲壳虫相似地得出Supperoveek
，Supperoveek culteek，p48cre；P48CRE; LSL-KRASG12D小鼠 ，育有6-10周龄的雄性P53LSL-R172H/LSLR172H; CHC/CHC; RIK/RIK MICE
。这种繁殖方案导致在小鼠染色体11上与CIS中的LSL-P53R172H和CHC基因座连接。简而言之
，在矿物油在7-8 h的矿物油下，在80μl下降的KSOM+AA（Millipore）中孵育7-8 h ，用M2培养基（My2 Mediiper（Millipore）（Mildipore）（千码中）（千里）中的二线（Milliip）（Millip）（Milliip）（Milliip）（千码）（均为cosr）（均为2i）（2i） 。在辐照的DR4小鼠胚胎成纤维细胞喂食层上
，直到膨胀进行冷冻保存和基因分型
。雄性p48cre; lsl-krasg12d; p53flox/wt; chc; rik和p48cre; lsl-krasg12d; p53lsl-r172h/wt; chc; chc; rik ES细胞进一步扩展以在M15+LIF培养基中靶向。 　　通过FLP介导的shRNA靶向肾上腺荧光素酶的shRNA的重组（指南：tagataagcattataattcct），将KPCSHRenilla/Loh Gemm-es细胞小鼠模型克隆到CTGM vector32中 ，开发了kpctre P48CRE; lsl-krasgrasgrasgrasgrasg12d; p53fik; p53fik; p53fik; p53fik; p53fik; p53fik；KPCSHP53模型是通过靶向p48cre; lsl-krasg12d; p53flox/wt; chc; chc; rik胚胎干细胞的靶向小鼠trp53（指导链：ttacacatgtacttgtgtagtgg，使用CTGM的细胞表现为cccccics of ccccc
，FLP介导的重组与编码Renilla荧光素酶的shRNA的CTGM载体生成KPCCIS-SHRENILLA或SHSMAD4（指南序列：CAAAGATGAATTGGATTCTTTT）生成KPCCIS-SHSMAD4 ES细胞 。 　　如先前所述的靶向和验证，如先前所述31在M15+LIF培养基中通过共同载体（LONZA核对象）与shRNA编码CTGM载体和FLP - 成年酶（CMV-FLPE）进行
。选择靶向细胞在湿霉素中 ，并分离并扩展抗性克隆。通过下面描述的基因分型PCR以及两个其他测试来确定整合体和条件函数的数量
，通过基因分型PCR进行了正确的整合 。（1）根据制造商在VIIA7 RT – PCR机器（Life Technologies）上的说明，对taqman拷贝数测定法对shRNA连接的GFP（Invitrogen）进行。（2）在功能上 ，用腺病毒CRE重组酶（爱荷华大学）处理表现出单一整合的克隆
，并在含多霉素的培养基（1μgml-1）中生长3天（1μgml-1），然后流式细胞仪 ，然后进行流式细胞仪（Guava细胞球仪
，Millipore； guavasoft; guavasoft v.4.0）以确保CRETA的表达仅在CRETA中得到表达
。在胚泡注射之前，所有ES细胞都没有分枝杆菌和其他微生物。如先前所述 ，胚泡注射到白化病BL6宿主中
，随后植入替代母亲31 。 　　所有动物实验均根据纪念斯隆 - 凯特林机构动物护理委员会批准的第11-06-018号议定书进行
。先前已经描述了所有小鼠菌株：P48-CRE51，LSL-KRASG12D52 ，P53FLOX53，LSL-P53R172H54
，CHC35和CAGS-LSL-RIK34菌株在混合的BL6/129JJ JJ上维持。没有预先确定动物实验的样本量，但所有实验都代表了至少三只不同小鼠的比较或至少三个不同供体注射细胞的结果 。图例中指出了每个实验的样本量
。基于零星肿瘤的发育将KPCLOH小鼠随机分为组。雌性小鼠在6至8周龄之间（Envigo）进行原位移植实验 。将BL6N小鼠交叉以生成原代小鼠胚胎成纤维细胞
。如上所述 ，将雄性ES细胞用于生成工程人群
，因此分析了雄性Gemm-ES细胞小鼠。这些雄性KPCLOH/SHRENILLA，KPCSHP53 ，KPCCIS-SHRENILLA和KPCCIS-SHSMAD4小鼠在强力霉素Chow上维持（625 mg kg-1
，每周两次，Harlan Laboratories每周两次补充 ，Harlan Laboratories）
，直到4周，直到Euthananasia 。在原位移植前一周 ，将无静脉裸体宿主放在强力霉素的chow上
，并保持在强力霉菌盘上，直到安乐死为止
。For both orthotopic or autochthonous tumour development studies, mice were immediately euthanized (end point) when the earlier of two conditions were observed: (1) the tumour size reached the limits defined in the approved animal protocol (specifically, tumours did not exceed a maximum diameter of 15 mm) or (2) if the mice presented with body condition indicative of cachexia, signs of discomfort, blood loss, abdominal distension indicative of继发性癌症如腹水 ，体重的重量> 20％的初次体重，严重感染
， 失血或呼吸困难。没有肿瘤超过批准的动物方案中定义的尺寸极限 。在标准温度和湿度下，在12 h – 12 h的光线周期中 ，动物分别在18-24°C和40-60％的情况下饲养。 　　根据制造商的说明
，使用QIAGEN ALLPREP DNA/RNA迷你试剂盒从分类的细胞和原代培养物中提取基因组DNA
。根据制造商的说明，使用下面列出的赫尔考酶聚合酶（Agilent）列出的引物进行基因组DNA（10 ng）进行扩增： 　　LSL-KRASG12D-WT ，LSL盒
，重组：（1）5'-GTCTTTCCCCCCCAGCAGCAGCAGTGC-3';（2）5'-CTCTTGCCTACGCCACCAGCTC-3';（3）5'-agctagccaccatggcttgagtaagtctgca-3'。 　　ROSA26-LSL-RTTA-IRES-MKATE2（RIK）：（1）5'-GGTGAGCGAGCTGATGCTGATTAAGG-3';（2）5'-TTTTTTGCCCGCGTACATGAAG-3' 。 　　p53flox WT，Flox ，重新组合：（1）5'-cacaaaaaaAcaggttaaAcccag-3';（2）5'-agcacataggaggagagagac-3';（3）5'-gaagacagaaaagggggaggg-3'
。 　　CHC WT
，COL1A1基因，靶向CHC：（1）5'-AATCATCCCAGGTGCACAGCAGCATTGCGG-3';（2）5'-GGATGTGGAATGTGTGCGAG-3';（3）5'-ATCAAGGAAACCCTGGATCACTGCG-3';（4）5'-CTTGAGGGCTCATGAACCTCCCAGG-3'。 　　基因分型PCR凝胶的原始图像在补充图1中提供 。 　　使用AllPREP DNA/RNA迷你套件（QIAGEN）从PDAC分离的流动DP和SP细胞中提取DNA
。在DNA上进行数字液滴PCR ，以根据制造商的说明
，使用T100热循环仪（Bio-Rad）检测针对WT p53，重组P53Flox ，CHC，WT KRAS和KRASG12D的探针。 　　Trp53 WT amplicon sequence and mm10 genome coordinates: TGGGAGCCGTGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGAAGTCACAGCACATGACGGAGGTCGTGAGACGCTGCCCCCACCTGAGCGCTGCTCCGATGGTGATGGTAAGCCCTCAACACCGCCTGT 　　MM10
，染色体11：6958847–69588569：+ 　　Krasg12d（WT/Mutant）扩增子测序，MM10基因组坐标：ttatttttttttttttttttttgtaaggcctgctgctgaaaaaatgactgagtgagtataaactataaacttggtggtggtggtggtggtggtg [g/a] 　　MM10 ，染色体6：145246710–145246832： - 　　肿瘤发育后
，由雄性kpcshrenilla/loh，kpcshp53 ，kpccis-shrenilla和kpccis-shsmad4小鼠的胰腺产生原发性癌症培养物和细胞系 。用剪刀将胰腺组织切成切
，并用稀释的汉克斯缓冲盐水溶液稀释的1 mg ml-1胶原酶V（Sigma-Aldrich）消化，然后用0.25％的胰蛋白酶稀释
。用完整的DMEM（DMEM ，10％FBS（Gibco）
，1×青霉素 - 链霉素）洗涤消化的组织，并在胶原蛋白涂层的板上（Purcol ，Advanced Biomomatrix
，0.1 mg ML-1）上生长，并用1μgml-Ml-1 doxycycycycy cat 377°C ，通过工程荧光等位基因的流式细胞仪进行原代培养物的身份验证，并常规对所有培养物进行分枝菌测试。 　　如前所述55
，处理用于分类或流式细胞术（以及原位移植中）的小鼠胰组织（以及原位移植） 。简而言之，用剪刀用汉克缓冲盐溶液洗涤 ，然后与胶原酶V（1 mg ML -1; Thermo Fisher Scientific;在Hanks Buffered Saline溶液中）
，然后将胰腺组织轻轻切碎，然后分离 ，然后在Hanks Buffered Saline溶液中分离）
，然后是胰蛋白酶（0.05％），最后一次分发（2 U ML -ML -ML -ML -1 ，Invitrogen）
。在所有酶孵育期间添加了DNase I（100μgml-1
，Sigma-Aldrich）。在胶原酶和胰蛋白酶步骤之间用PBS洗涤细胞，并在胰蛋白酶和分配酶步骤之间用FACS缓冲液（2％FBS ，10 mM EGTA
，PBS）洗涤 。然后将悬浮液通过40μm的网格过滤，并在FACS缓冲液中以300 nm DAPI的散装或单细胞排序重悬于ARIA3 Sorters上的96孔板（BD）（BD ，由MSKCC流式细胞仪维持; FACS Diva V.8.0）。在原位移植后肿瘤生长后，分解的胰腺流式细胞仪和指定时间点的原代培养物在fortessa Instruments上进行（BD
，由MSKCC流式细胞仪设施维持； FACS Diva v.8.0）
。如前所述56在Attune NXT流式细胞仪（Invitrogen; Attune nxt v.3.1）上使用NST-DAPI缓冲液进行倍形分析。以下更详细地描述了人类PDAC流式细胞术和单细胞测序的倍性分析 。为了计算肿瘤多倍体分布的中位数倍曲，计算并乘以2（例如 ，假设二倍体分布的中值倍loidy为2）
。补充图2说明了基于MKATE和GFP和DAPI荧光的门控策略。 　　在用IDEXX/RADIL执行的石蜡嵌入和切片之前
，将组织在4°C的10％福尔马林中固定过夜 。使用IDEXX/RADIL的常规方案进行H＆E染色
。对于免疫荧光染色，将5μM切片脱蜡并用组织/酒精系列和抗原回收进行补水 ，并通过在1×柠檬酸盐抗原检索缓冲液（Vector）中煮沸进行抗原检索。在5％BSA的PBS中阻塞载玻片
，并在4°C下阻止缓冲液进行一夜之间进行原代抗体染色 。对于IHC染色，内源性过氧化物酶在抗原检索后通过在室温下用3％过氧化氢处理15分钟来阻断抗原检索后
。The following primary antibodies were used: chicken anti-GFP (1:500, Abcam, 13970), rabbit anti-mKate2/Turbo RFP (1:1,000, Evrogen, AB233), mouse anti-Ki-67 (1:500, BD, 550609), rabbit anti-p53 (1:100, NCL-L-p53-CM5p, Leica Biosystems).使用以下荧光偶联的二抗以1：500稀释来检测一抗：山羊anti-chicken AF488（Invitrogen ，A32931）
，山羊抗兔555（Invitrogen，A32732） ，A32732）
，A32732，A32732 ，A32732，goat Anti Anti Anti Anti Anti Anti抗Mouse AF633（AF633）（AF633（AF633）（AF633）（AF633（AF633）（AFITOgen）将所有二级抗体在阻塞缓冲液中稀释并在室温下孵育1小时。洗涤染色的载玻片
，并用含有DAPI的PB对核染色，并将其安装在带有延长黄金（Lifetechnologies）的盖板下 。使用IHC IMMPRESS HRP山羊抗兔IgG聚合物过氧化物酶检测试剂盒（VectorLabs ，MP-7451）在室温下使用IHC IMMPRESS HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP HRP抗体进行标记
，并用DAB试剂（vectorlabs，SK-4100）开发
。脱水后 ，用血久毒素对IHC切片进行了染色
，并用Vectormount（vectorlabs，H-5000-60）安装。使用Zeiss AxioImager显微镜使用Zeiss Zen 3.3软件获取图像 。使用Aperio versa系统进行匹配的组织学（H＆E）和免疫荧光的载玻片扫描 （Leica）带有Aperio versa应用程序（v.1.0.4）软件。 　　按照描述为500μl的完整DMEM ，将总共从肿瘤或非肿瘤轴承小鼠分类的500 dp或SP细胞分类
。将细胞转移到purcol涂层的（如上所述）的12孔板上
，并使用番石榴流动细胞仪（Millipore Software，Guavasoft V.4.0）在生长2周后计数细胞数。 　　如所述 ，将DP和SP细胞从肿瘤和非肿瘤的小鼠中分选 。对于含有肿瘤的小鼠
，将10,000或25,000个细胞分类为FACS缓冲液（PBS，2％FBS）；对于非肿瘤轴承小鼠 ，将100–1,000个SP细胞分类为FACS缓冲液（PBS，2％FBS）
。为了与从非含量小鼠分类的SP细胞进行比较
，对含有肿瘤的小鼠的100个SP细胞进行了排序。用PBS洗涤细胞，将无血清DMEM和生长因子还原的Matrigel（Corning）重悬于25μl的1：1混合物中 ，并使用汉密尔顿注射器装有26个孔针头
，并将其注射到裸露的裸体小鼠的裸露胰腺中 。接受者小鼠在手术前2天注册了强力霉素CHOW（625 mg kg -1，哈兰实验室） ，并维持强力霉素chow
，直到因肿瘤达到IACUC批准的人道端值而导致的肿瘤引起的肿瘤造成的肿瘤负担（见上文）
。如果未形成肿瘤，则对小鼠进行监测 ，直到因健康状况下降而对其进行安乐死。 　　使用三色探针在石蜡切片上进行了DNA荧光原位杂交（DNA-FISH）分析
，该探针设计用于检测探针中使用的细菌人造染色体克隆的拷贝数变化 。RP23-340D4，RP23-60M16;用光谱红色标记）和2QC（RP23-332C13 ，RP23-186P20
，RP23-435A5；用Spectrum Green标记）
。所有RP11克隆均购自罗斯威尔公园癌症研究所基因组学共享资源。根据在分子细胞遗传学核心设施上建立的程序进行探针标记，杂交 ，杂交后洗涤和荧光检测 。使用配备ISIS成像软件（Metasystems）的Zeiss Axioplan 2i落叶显微镜（Carl Zeiss显微镜）扫描载玻片
。首先对整个部分进行扫描，以评估信号模式。相应的H＆E和/或免疫染色的载玻片用于鉴定前态度或癌症形态（腺癌的焦点）的区域 。通过组织的深度（以0.5μm的间隔为12 Z段的压缩堆栈）对选择的区域进行成像
，并且对于每种情况，在每个代表性区域内至少进行了至少50个离散核。 　　为了定量MKATE/GFP DP和PDAC小鼠中MKATE SP细胞中KI-67的免疫荧光染色 ，在严重的预立剂和PDAC组织区域收集了5个随机×10图像
。为了定量PDAC发育之前的Mkate/GFP DP和Mkate SP细胞中Ki-67的免疫荧光染色
，从9只小鼠中收集了一个胰腺横截面中含有所有没有PDAC形态的所有SP细胞的20个没有PDAC形态的×20个领域。这些小鼠中的三只还显示了初始PDAC的焦点区域，其中收集了多达5个随机×20场 。GFP ，MKATE2
，KI-67和DAPI同时染色了肿瘤和非肿瘤小鼠胰腺的组织切片
。使用半自动化策略对DP和SP细胞中KI-67级分进行定量。首先，使用MATLAB使用高斯滤波器对图像进行背景和处理 。其次 ，使用基于OTSU的分割在MATLAB中鉴定了核（DAPI+）和上皮（MKATE2+和/或GFP+）细胞
。第三
，根据MKATE2和GFP状态将上皮细胞分为SP或DP。第四，通过应用固定阈值 ，将细胞提名为KI-67+
，这是通过从所有视野中汇总数据来确定的 。最后，通过分别检查每个图像 ，可以手动纠正KI-67状态的分配
。对于含有罕见的肿瘤前SP病变的领域，DP细胞的人数大大超过了SP细胞
，将DP细胞随机取采样以匹配在同一视野中发现的SP细胞数量。在分析中排除了没有DP或SP细胞的视野 。对于这两种分析，Wilcoxon的排名和测试都用于比较这些组
。 　　为了确定组织病理学定义的预定义和PDAC细胞中MKATE/GFP DP和MKATE SP细胞的频率 ，从6个含6个PDAC的胰腺中的H＆E染色幻灯片上鉴定出了20个随机场的病变。感兴趣的病变由对免疫荧光数据视而不见的病理学家分类 。在分析的6只小鼠中有4个田地中鉴定出定义为ADM的病变
，并在6只小鼠中有5个田间鉴定出定义为Panin的病变。 　　为了在PDAC发育之前对小鼠的Mkate SP细胞进行组织学分类（图1G），在没有Frank PDAC的七个胰腺中鉴定了43个含Sp细胞的病变 ，并使用Mkate和GFP进行免疫荧光
。然后在连续的H＆E染色切片上鉴定出这些病变
，并由对免疫荧光数据视而不见的病理学家进行分类。 　　对于基于形态和p53基因型的DNA捕量定量，如上所述 ，在5个前肿瘤前kpcloh胰腺上进行了第2、9和10染色体的鱼 。基于H＆E和顺序切片的荧光染色
，收集了含有PDAC或前态形态的SP细胞的场
。接下来，从鱼染色的载玻片上取下盖板 ，并在4°C下用PBS洗涤1小时以去除安装介质
，如所述，对MKATE和GFP进行了免疫荧光染色。然后 ，在具有PDAC或前态形态的经过验证的SP细胞中，将鱼灶在50个离散细胞中评分 。 　　如上所述
，从福尔马林固定的石蜡包裹的组织的连续切片中鉴定出LMD的区域，如上所述
。将LMD的切片放置在膜载玻片（PPS-Mmbrane Framesslides ，11600294
，Leica）上，并经过补液和轻催血蛋白染色。使用感兴趣的手绘区域切割与Mkate/GFP DP或Mkate SP免疫荧光信号相对应的上皮区域 ，并使用LEICA微型分解软件（V.7.5.5.1）在具有LMD7000激光显微镜显微镜（Leica）的PCR管中收集 。根据制造商的推荐方案
，使用Qiagen Qiaamp DNA FFPE高级试剂盒（56604）分离DNA
。 　　从TCGA基因组数据CONSONS数据门户（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载经过处理的分割的单核苷酸多态性（SNP）阵列数据。为了滤除虚假的单探针片段，将阵列探针坐标转换为基因组箱坐标 ，该坐标用于接受/拒绝一个段 。通过汇总bin值并接受每个bin中的增益/缺失指定的阈值±0.1
，在转换的数据集（n = 186个患者样品）上进行频率图分析
。与截短，剪接位点或结构变体体细胞变异相比 ，大约66％的样品包含TP53点突变。在错义分类突变中
，约有30％的残基被指定为热点（例如Arg175，arg248和arg273） ，这是三个最常见的位点） 。如先前所述57进行了人与小鼠的同步分析。人参考人类构建HG19和小鼠参考基因组构建MM9用于分析，同时选择了400 kb的连续序列的分辨率
。 　　如上所述
，将DP和SP细胞从PDAC和非肿瘤轴承胰腺分解，并处理流式细胞仪。对于从PDAC样品中的散装SP/DP排序 ，该仪器以高纯度模式设置为细胞仪后颗粒
，并根据制造商的说明使用AllPREP DNA/RNA Mini Kit（QIAGEN）处理DNA/RNA提取DNA/RNA 。随后，如前所述58处理了500 ng的基因组DNA以生成图书馆
。对于来自肿瘤的单细胞沉积和全基因组扩增（WGA）以及截-穆尔样品 ，使用在单细胞模式下设置的仪器对单细胞进行对单细胞进行排序
，并在处理每个独特样品之前，在处理自动细胞沉积单元和清洗步骤之前进行了重新/校准和洗涤步骤。如前所述56 ，将单细胞（DP和SP）沉积在96孔板的孔中
，该井中用9μL裂解缓冲液制备 。补充表1中总结了每个样品类别的单细胞数量（例如，肿瘤或肿瘤前）
。对于单细胞WGA ，我们使用了DOP-PCR WGA的修改版本
，这是一种经验上确定的WGA方法，该方法已确定为产生高度准确的单细胞拷贝数数据59,60,60,60,61。修改方法在WGA扩增反应的第二步中引入了内联条形码序列 。WGA之后 ，根据制造商的建议，使用Qiaquick 96 PCR纯化套件纯化单细胞WGA DNA产品
。随后
，使用NEBNEXT试剂盒（NEB）对每个细胞的WGA DNA（100 ng）进行相同量的WGA DNA（100 ng），对纯化的DNA进行定量。为了测序LMD材料 ，洗脱的DNA受到如上所述的WGA方案和下游序列文库制备的准备 。使用单端101 bp读取在HISEQ2500仪器上测序测序库
，同时以每个单细胞的平均覆盖范围为100万个读数， 以前确定的覆盖范围足以在600 kb58的bin分辨率下进行准确的全基因组拷贝数测定
。每个细胞至少需要250,000个读取才能包含在下游分析中。 　　批量 ，LMD和单细胞测序数据映射到小鼠参考基因组构建MM9
，同时跳过包含内联条形码序列的前50个bp以及DOP-PCR准脱位序列 。随后将索引，分类和PCR重复项进行了索引 ，然后删除。用先前开发的算法（VARBIN）62计算出独特的映射测序读数
。该基因组的长度分为5,000箱
，长度约为600 kb。随后，使用Lowess平滑算法63对GC含量进行了校正 ，该算法使用圆形二进制分段进行了归一化和分割64 。使用最小二乘拟合算法推断出倍性
，同时考虑整数bin值分配分布58
。对于下游的单细胞分析，使用算法CORE65分别定义为分别定义为删除和增益 ，将绝对拷贝数调用以下或更高的参考正常（副本编号= 2个单细胞= 2个单细胞= 4）。使用正交复制号调用算法（HMMCopy47）类似地处理数据集 。结果是人类和小鼠数据集的两个分析管道之间的高度一致性，并在补充图3中进行了说明
。对于批量频率图分析
，所有样品的归一化段均以平均值为1的平均值为1，用于定义/删除箱的阈值为±0.1。为了说明跨序列样品中的单细胞拷贝数谱图 ，使用从单细胞数据中估算的绝对拷贝数值构建了PDAC（SP和DP）的热图（SP和DP）和肿瘤前SP单细胞
，并使用曼哈顿疾病的病房方法聚类 。 　　MM10的杂种基因组具有EGFP和Mkate的序列元素，然后为BWA索引
。首先 ，使用BWA将原始的FASTQ数据与读取映射到两个反元元素（EGFP和MKATE）以及基因CLP1和TRP53的读数计数首先映射到杂种基因组
，然后使用床层覆盖率收集。对读取进行过滤以删除补充对齐，并标记了替代命中（XA：Z：BWA标志） ，并使用MAPQ <30 。然后使用R脚本处理所得的覆盖范围文件
，以将计数归一化为RPKM值，然后按基因和样品类型绘制正常化的覆盖范围的分布
。 　　Phylogenetic and clonal relationships between DP and SP cells from PDAC and pre-tumour mice were investigated using two orthogonal methods: a change-point/breakpoint-based analytical method66,67 as implemented using the SCC lust software package (available at GitHub/KrasnitzLab) and a minimum-event distance (MED) method that models whole-genome duplication events in reconstructing phylogenies and ancestral基因组（Medicc268）。简而言之 ，Scclust确定了整个单细胞基因组的整数值拷贝数轮廓 。对于所有成对的细胞
，使用Fisher的精确测试来对变化点重合进行差异，并用于层次结合细胞基因组。叶片之间具有统计学意义的高度相似性的树节点被认为是从克隆细胞种群中取样的
。为此 ，与细胞之间随机变化点随机互换后的差异分布相比，FDR在对细胞对中的统计学意义进行了量化。除了“ keepboundaries ”参数（设置为true）之外
，SCCLUST与默认参数一起使用 。图3A是使用先前描述的可视化工具（单细胞基因组查看器）制备的，66可从GitHub/Krasnitzlab获得
。在MedCICC2中 ，将拷贝数段作为正整数向量表示
，其算法求解了副本对数之间的MED（例如，profiles =单个单元格的骨料段）。该算法还使用一组约束 ，建模全基因组重复事件
， 如参考文献所述，包括染色体边界的会计 。68. Medicc2基于单个细胞的估算MED值构建系统发育树 ，同时最大程度地减少了解释一个轮廓转换为另一个轮廓的事件的总数
。总共使用了200个重采样引导程序的迭代
，用于对二倍体和多倍体单细胞之间的分支关系分配信心。Medicc2提供了有关分支/节点关系的Bootstrap置信度统计的支撑树面板，可在补充图2中获得 。前肿瘤1和3分别为4和5
。由于与人类相比 ，由于C57BL/6NJ菌株背景的近交性实验室小鼠的基因组缺乏杂合SNP（构建了KPCLOH模型）
，因此Medicc2使用总拷贝数而没有使用阶段信息的总拷贝数。与一个普通人的平均人相比，杂合子SNP约为150万个 ，近交C57BL/6NJ小鼠的杂合子SNP的平均数量为16,000 。该统计量从Sanger鼠标基因组项目（ftp://ftp-mouse.sanger.ac.uk/rel-1303-snps_indels-grcm38/mgp_v3_stats.txt）中获取
。 　　从EGA（登录EGAD00001006152）下载了微解剖胰腺肿瘤的WGS数据23。如前所述56，随后将WGS数据删除到大约1000万个测序读取的深度
，用于复制单位分析 。简而言之，将测序读数映射到人类参考基因组HG19中 ，并具有独特的映射读取和索引。随后使用先前描述的算法（VARBIN）62在20,000箱中对基因组进行分区时
，在基因组箱中进行了唯一映射读数
。读取bin计数均标准化基因组，并使用圆形二进制分段进行随后的处理64。对于绝对拷贝数定量 ，使用最小二乘拟合算法的分段数据与算法的参数构成算法的参数
，该算法受到了从先前发表的算法（赛lul固醇）23得出的ploidy值的约束 。如小鼠单细胞数据所做的那样，使用hmmcopy类似地处理了测序读数 ，结果很大程度上是一致的
，如补充图6所示
。TP53突变类型统计量与TCGA队列所述的相似（上述）。随后将绝对拷贝数数据分为三类，以进行下游分析：二倍体/TP53单行型/WT ，二倍体/TP53-双乳液和多倍体/TP53-Biallelic 。对于TP53享有的等位基因状态的关联分析
，使用Fisher精确检验来实现显着性
。对于TP53等位基因和倍性类别，我们使用算法CORE65得出了显着的复发CNA ，该算法CORE65计算出显着复发性CNA的得分和基因组坐标，其与给定数据集中的分数成正比（即患者队列）。比参考正常/伪级（二倍体2;多倍体4）的复制数调用分类为删除或增益事件
，， 分别 。富集事件类型的统计检验基于t样本t检验的意义
。为了分析缺失和收益的异质性/同质性水平 ，Facets69（https://github.com/mskcc/facets/;版本10月8日
，2021年； Commit 3058BBA）用于处理全基因组测序数据。为了生成SNP计数文件，使用DBSNP v.137的清洁版本（仅包含SNV且删除重复项）运行SNP-Pileup命令 。然后 ，使用手册中所述的标准方面方法对所得的肿瘤/正常堆积进行处理
。具体：mat = readsnpmatrix（countfile）
，xx = preprocypample（mat，snp.nbhd = 1000） ，oo = procsample（xx
，cval = 500），fit = emcncf（oo）。通过获取每个段的估计细胞分数（CF）统计量相对于测序样品的计算纯度（例如CF/纯度） ，并使用Kolmogorov – Smirnov测试来分析染色体片段的推断异质性/同质性/同质性 。使用两个样本的Kolmogorov – Smirnov检验来确定分布之间差异的重要性。 　　分析了使用MSKCC机构靶向测序面板（MSK-IMPACT）测序的1,077例PDAC病例
。使用方面（v.0.5.13）69计算合格性测定
，全基因组总和特异性DNA拷贝数，纯度和倍性。根据观察到的变体等位基因分数和局部倍元70 ，生成了指定TP53等位基因状态的每个突变的预期副本数量 。使用二项式分布和最大似然估计来计算癌细胞级分，以产生后概率71
。如上所述进行了推断的异质性/同质性/同质性
，并使用两侧Kolmogorov – Smirnov检验进行了类似测试的统计显着性。手动进行了疾病扩散和患者结局的临床注释，随后用于基因组相关分析 。为了在倍性状态和疾病扩散之间具有显着相关性 ，实施了Fisher精确测试
。单变量COX回归分析用于确定疾病扩散的预后预测价值。 　　如前所述56
，从九个切除的PDAC（四个二倍体和五个多倍体）进行TP53的双乳脂突变体进行了单核分离 。MSKCC机构审查委员会（MSKCC IRB）批准了涉及切除样品的研究
。简而言之，在有1 ml的核分离缓冲液（NST-DAPI）的情况下 ，切开了两个50μM组织切片并使用一对手术刀进行机械解离。随后根据DNA含量与从二倍体和多倍体栅极收集的单核（当存在）中分类DAPI染色的核（如上所述
，并沉积在带有核裂解缓冲液预装的96孔板中 。如上所述，对使用NEBNEXT库制备试剂盒（NEB）进行的下游序列库进行了单核WGA扩增
。在HISEQ2500仪器上对库进行了测序 ，用于单端101 bp测序
，同时以每个单元格的范围覆盖约1200万次。如前所述58，对单细胞反复分类的测序数据进行处理以确定绝对拷贝数 。绝对拷贝数转换为最近的整数 ，并推断出均匀性得分作为整个基因组的每个垃圾箱的主要整数拷贝数状态的频率。 　　该工作中生成和使用的质粒
，小鼠ES细胞和原代癌细胞系可从相应的作者获得
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。