完整的人类染色体8的结构，功能和演变

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见 。 　　作为研究研究的一部分（IRB MWH-20-054）的一部分 ，CHM13HTERT（CHM13）细胞最初是从Magee-Womens医院的氢化痣中分离出来的
。从该培养物中生长的冷冻冷冻细胞与人端粒酶逆转录酶（TERT）基因转化
，以使细胞系永生。该细胞系已通过STR分析进行了身份验证，对支原体污染的阴性测试 ，并进行了核分型显示46
，XX Karyotype13 。人类HG00733淋巴细胞细胞最初是从一名女性波多黎各儿童那里获得的，该儿童与爱泼斯坦 - 巴尔病毒（EBV）永生 ，并存储在科里尔医学研究所
。黑猩猩（Pan Troglodytes; Clint; S006007）成纤维细胞最初是从Yerkes国家灵长类动物研究中心的名为Clint（现已去世）的男性西方黑猩猩（现已去世的）获得的
，并与EBV永生。猩猩（Pongo abelii; Susie; Pr01109）成纤维细胞是从Gladys Porter Zoo的名叫Susie（现已去世）的雌性Sumatran猩猩雌性获得的，该动物园与EBV永生 ，并存储在Coriell Institute进行医学研究 。猕猴（Macaca Mulatta; AG07107）成纤维细胞最初是从印度雄性猕猴中获得的
，并存储在Coriell医学研究所
。据我们所知，尚未对HG00733 ，黑猩猩，猩猩和猕猴细胞系进行身份验证或评估。 　　将CHM13细胞培养在补充15％amniomax C-100补充剂（Thermo Fisher Scientific
，12556015）和1％青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Thermo Fisher Scientific ，15140140122）中
，在完整的Amniomax C-100基础培养基（Thermo Fisher Scientific，17001082）中培养 。在RPMI 1640中培养了HG00733细胞 ，其中谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific
，11875093）补充了15％FBS（Thermo Fisher Scientific，16000-044）和1％Penicicillin-streptypycin（Thermo Fisher Scientific ，15140122）
。Chimpanzee (P. troglodytes; S006007) and macaque (M. mulatta; AG07107) cells were cultured in MEMα containing ribonucleosides, deoxyribonucleosides and -glutamine (Thermo Fisher Scientific, 12571063) supplemented with 12% FBS (Thermo Fisher Scientific, 16000-044) and 1%青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific
，15140122）。猩猩（P. abelii; PR01109）细胞在含有核糖核苷，脱氧核糖核酸 ，脱氧核糖核苷和 - 谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific
，12571063）中培养，并补充了15％FBS（Thermo Fisher Scientific Sc​​ientific ，16000-044）和1％Peniciccilinscicric Comentific inscricitific fistericciencienciencicieny 01％penicicciccienciencienciencienciencienciencienciencienciencienciencienciencienciencienciencienciencienciencieny01 15％ 。所有细胞均在37°C的湿度控制环境中培养，使用5％CO2培养。 　　如前所述的36
，PACBIO HIFI数据是从HG00733，黑猩猩 ，猩猩和猕猴基因组中生成的
。简而言之
，使用改良的Qiagen gentra Puregene细胞试剂盒协议从细胞中提取高分子量（HMW）DNA 37。HMW DNA用于通过Smrtbell Express模板Prep Kit V2和Smrtbell酶清洁套件（PACBIO）生成HIFI库 。使用鼠尾草（Sage Science）进行尺寸选择，并选择了分数的11
、14、18 、22或25 kb（由FEMTO脉冲（Agilent）确定）进行测序
。在续集II平台（仪器控制SW V7.1或V8.0）上进行了三到七个SMRT单元格8M（PACBIO）的序列II测序1.0和12小时的化学测序或12小时的预延伸或续集II测序化学2.0和3-或4-H预延伸 ，旨在使用30小时的电影
，针对30小时的尺寸，将3.2×25 i覆盖效果 ，对图书馆进行了测序。GB） 。使用CCS算法（v.3.4.1或V.4.0.0）处理的原始数据具有以下参数：–minpasses 3 - miminpassivical accuracy 0.99 - maxlength 21000或50000
。 　　根据先前发布的协议41
，从CHM13，HG00733 ，黑猩猩和猩猩基因组生成了超长的ONT数据。简而言之
，将5×107的细胞裂解在含有10 mM Tris-CL（pH 8.0），0.1 M EDTA（pH 8.0） ，0.5％（w/v）SDS和20μgml-1 RNase A的缓冲液中裂解1 h 。加入蛋白酶K（200μgml -1），并将溶液在50°C下孵育2小时
。通过两轮25：24：1酚 - 氯仿 - 异氧化酒精提取
，然后进行乙醇沉淀，将DNA纯化。将沉淀的DNA溶解在10 mM Tris（pH 8）中 ，在4°C下含有0.02％Triton X-100
，持续两天 。使用快速测序套件（SQK-RAD004）从ONT进行修改到制造商的协议，构建了库
。具体而言 ，将2-3μg的DNA重悬于总体积为18μl的总体积中
，并用16.6％的FRA缓冲液重悬。将FRA酶稀释到FRA缓冲液中2至12倍，将1.5μl的FRA添加到DNA溶液中 。将DNA溶液在30°C孵育1.5分钟 ，然后在8°C下孵育1分钟
，使酶失活。将RAP酶稀释到RAP缓冲液中2至12倍，并将0.5μl的RAP添加到DNA溶液中
。将DNA溶液在室温下孵育2小时 ，然后加载到使用Minknow（v.2.0-v1.9.12）上在网格上进行测序的引发液flo -min106 r9.4.1流动池。 　　额外的ONT数据是从CHM13
，HG00733，黑猩猩 ，猩猩和猕猴基因组产生的 。简而言之，使用改良的Qiagen Gentra Puregene Cell Kit方案从细胞中提取HMW DNA 37
。将HMW DNA从ONT的连接测序试剂盒（SQK-LSK109）制备到文库中
，并使用Minknow（V.2.0 – V.19.12）加载到启动的Flo-Min106或Flo-Min106或Flo-Pro002 R9.4.1流动池中，用于在电网或Promethion上进行测序。所有ONT数据均以Guppy 3.6.0或4.0.11的碱为基础 ，并带有HAC模型 。 　　如前所述5
。使用HIFIASM6（V.0.7）从PACBIO HIFI数据（补充表3）组装HG00733基因组。黑猩猩
，猩猩和猕猴的基因组是使用Hicanu5（v.2.0）从PACBIO HIFI数据（补充表5）组装而成的 。每个组件的重叠群用于替换目标区域中基于ONT的序列支架（如下所述）
。 　　人类8号染色体中的间隙区域是通过基于沉没的方法将PACBIO HIFI和ONT数据结合在一起的基于组装的。具体而言，使用HIFI数据集的测序覆盖范围 ，使用CHM13 PACBIO HIFI数据通过水母（v.2.2.4）生成一个Sunks（K = 20；总计= 2,062,629,432） 。用CHM13 Illumina Data（SRR3189741）验证了CHM13 PACBIO HIFI Sunks的99.88％（2,060,229,331）
。CHM13超长ONT的子集读取与CHM1β-防御素贴片（GenBank：KZ208915.1）或GRCH38染色体8参考序列（CHR8：42,881,543–47,029,467）内的CHM1β-防御素贴片（GenBank：KZ208915.1）或选择区CHR8：85,562,829–85,848,463
，用于8Q21.2基因座）用光明会验证的阳光进行了条形码。选择共享至少50个日光浴的读数进行检查，以确定其沉没条形码是否重叠 。沉没的条形码可以由“有效
”和“无效”晒黑组成。有效的阳光是一次在基因组中发生的 ，并且位于读取的确切位置
。相比之下
，无效的阳光是曾经在基因组中发生的，但位于读取的位置 ，这可能是由于测序或基本呼叫误差所致。条形码在条形码中被鉴定为与同一读取中至少有其他十个阳台共享成对距离的那些 。将至少包含三个有效阳光及其相应的成对距离（读取长度的±1％）的沉没条形码共享的读物被组装成瓷砖
。使用瓷砖和子集的超长ONT重复该过程几次
，直到生成跨越间隙区域的序列支架为止。脚手架组织的验证是通过三种独立方法进行的 。首先，对序列支架和基础读取读数进行了重复测试器（v.3.3.0） ，以确保读取重叠在重复结构中是一致的
。第二， 对丝粒支架和基础读取读数进行了弦乐式读取器42
，以验证HOR组织在重叠式读取中。最后，将每个目标区域的序列支架纳入了先前生成的5个CHM13染色体组件中 ，从而填补了8号染色体组件中的间隙 。CHM13 PACBIO HIFI和ONT数据通过PBMM2（v.1.1.0）（用于PACBIO数据; https：//github.com/pacificbiosciosciences/pbim2）或winnowmap43（winnowmap43（v.1.0）（v.1.0）（v.1.0）（collaps collaps）（collaps collaps）（collaps collaps collaps）（collaps collaps collaps collaps collaps）
，将PACBIO HIFI和ONT数据对齐与整个8号染色体组装（v.1.1.0）（v.1.1.0）（有关PACBIO数据;尽管基于ONT的支架在结构上是准确的，但由于原始ONT读取中的基本呼吸误差 ，因此在基础水平上仅准确87-98％
。因此
，我们试图通过用从CHM13 Genome5组装的PACBIO HIFI重叠群代替ONT序列来提高序列支架的基础准确性，而CHM13 Genome5的共识精度大于99.99％5。因此 ，我们将通过Hicanu5生成的CHM13 PACBIO HIFI重叠与通过miniMAP244（v2.17 -R941;参数：Minimap2 -t 8 -i 8g -i 8g -a -eqx -X asm20 -s 5000）识别与基于高序列的高序列确定的CONTIG的CHM13 PACBIO HIFI重叠合物与8号染色体组合在一起 。典型的支架具有与其中区域对齐的多个PACBIO HIFI重叠群
。因此
，在必要时使用脚手架来订购和定制pacbio hifi重叠群和它们之间的桥梁差距。PacBio HiFi contigs with high sequence identity replaced almost all regions of the ONT-based scaffolds: ultimately, the chromosome 8 assembly consists of 146,254,195 bp of PacBio HiFi contigs and only 5,490 bp of ONT sequence scaffolds (99.9963% PacBio HiFi contigs and 0.0037% ONT scaffold).8号染色体组件被纳入了先前生成的5个CHM13的全基因组组件中，以通过正交方法验证（下面详细介绍） 。HG00733 ，黑猩猩
， 猩猩和猕猴8 centromeres通过相同的基于沉没的方法组装。 　　使用Merqury17估算了从映射的K-MER估算CHM13染色体组件的精度
。简而言之，Merqury（v.1.1）在8号染色体组件上运行 ，具有以下命令：eval/qv.sh chm13.k21.meryl chr8.fasta chr8_v9。 　　CHM13 Illumina数据（SRR1997411，SRR3189741
，SRR3189742和SRR3189743）用于识别具有K = 21的K-MER 。在Merqury中，在Merqury中 ，每个K-Mer在Illumina K-Mer k-Mer base-base-base in in ofrimina k-Mer-base in in ofrim as base中均可评估'in Illumina k-Mer''in Ill''in Ill''in Ill''''''''我们检测到仅在146,259,650的组装中发现的1,474 k-mers
，导致质量值得分为63.19，估计如下：-10×log（1-（1 - 1-1-1474/146/146,259,650）（1-1474/146,259,650）（1/21）（1/21）（1/21）= 63.19）= 63.19
。 　　从该质量值得分估计的8染色体的精度百分比为：100-（10（63.19/-10））×100 = 99.999952。 　　还从测序的BAC中估算了CHM13染色体8组件和β-防御素基因座的准确性 。简而言之 ，通过miniMAP244（v2.17 -r941）将CHM13染色体8（BAC库VMRC59）的66个BAC与8染色体组装在一起
，其中包括以下参数：-i 8G -2K -2K 1500m -a -e -a -e -a -a -a -a -a -a -eqx -y -y -e -eqx -y -x asm20000 -i00 00，000 000,00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000岁-RR-e 4,1 -b 5
。然后 ，使用由此产生的BAM中的雪茄串估算质量值
，根据以下公式将一致性差异视为错误： 　　整个8号染色体组件的中值质量值为40.6988，β-Defensin基因座的中值为40.4769（Chr8：6300000–133300000；估计的47个单独的BAC估计）（有关更多详细信息 ，请参见扩展数据图5）
，在整个Chromosome中，这是95％的置信区间。该质量值评分用于估计基本准确度36如下： 　　BAC质量值估计应视为下限 ，因为BAC和组装之间的差异可能源于BAC序列本身的错误 。先前显示BAC偶尔包含基础PACBIO HIFI读数不支持的测序误差36
。此外，估计的BAC质量值的上限​​限制为大约53
，因为BAC通常为200 kb，因此 ，最大可计算质量值为200 kb的1误差（质量值53）。我们还注意到
，由于BAC文库制备中的偏见，无法从BAC估算中心区域的质量值 ，这阻止了BAC克隆中的centromeric序列 。 　　HG00733
，黑猩猩，猩猩和猕猴8 Centromere组件的准确性估计为Merqury17
。简而言之 ，如上所述
，Merqury（V.1.1）在Chm13染色体组件上所述的Centromere组件上运行。最终，我们检测到仅在3,877,376 bp的HG00733孕产妇组装中发现的248 k-mers（估计质量值评分为55.16；基本准确度为99.9997％）；仅在3,597,645 bp的HG00733父亲组装中发现了10,562 k-mers（估计质量值评分为38.54；基本准确度为99.986％）；仅在2,803,083 bp的黑猩猩H1组装中发现的0 k-mers（估计的无限质量得分；基本准确度为100％）；仅在3,603,864 bp的黑猩猩H2组件中发现了20 k-Mers（估计质量值评分为65.7796；基本准确度为99.9999％）；仅在5,372,621 bp的猩猩组装中发现了1,302 k-mers（估计质量值评分为49.3774；精度为99.9988％）；14,999,980 bp的猕猴组装中仅发现了104个K-MER（估计质量值评分为64.8128；精度为99.9999％） 。我们注意到 ，梅尔克里（Merqury）检测到在原始读取中没有支持的组装中存在错误的k-mers
，但无法检测到组装的重复副本中的真实K-mers（变体）。因此，在这些高度重复的阵列中 ，梅克里对比较分析很有用，但可能高估了共识的总体准确性
。 　　我们使用Strand-Seq数据评估了包括Centromere在内的CHM13染色体组件的定向和结构连续性。首先
，将所有由CHM13 Genome 36产生的链序列库均与CHM13组件对齐，包括使用BWA-MEM45（V.0.7.17-R1188）的8染色体组合 ，并带有配对端映射的默认参数 。接下来
，重复的读数以Sambamba46（v.0.6.8）标记，并在随后的分析之前删除
。我们使用samtools47（v.1.9）为每个链序列库排序和索引最终的BAM文件。为了检测8号染色体组件中的假定缩放断点 ，我们在所有BAM文件上运行了breakpointr48以检测链态断点 。在多个链序列库中链状态的复发变化39
。为了提高我们对错误组装检测的敏感性
，我们创建了一个“复合文件 ”，该文件将方向读取所有可用的strand-seq库中读取49,50。接下来 ，我们使用“ runbreakpointr
”函数在“复合读取文件”上进行了breakpointr
，以检测纯合的区域（“ ww ”；“ hom
” - 所有读取都以减去方向映射）或杂合倒置（“ wc”，“ het ” ，“ het
”
，'het' - 大约等于读取的读取中的含量和加上含量的映射） 。为了进一步检测8号染色体组装中的任何假定的嵌合体，我们应用链序列将200-kb的8染色体组件的长块分配给使用Saarclust39,51的单个染色体同源物的独特组
。为此 ，我们在所有BAM文件上都使用了Saarclust函数“ cackaffolddenovosemembly”。 　　Bionano基因组学数据是从CHM13 Genome13产生的 。在Bionano Saphyr仪器上收集了用Bionano直接标记酶标记的长DNA分子，以覆盖130倍
。将分子与Bionano组装管道求解（v.3.4）组装在一起
，使用非Haplotype-Inaweawaence参数和GRCH38作为参考。所得数据产生了261个基因组图，总长度为2.921.6 MB ，基因组MAP N50为69.02 MB 。 　　将分子集和非拼写型图图与CHM13草案组装和GRCH38组装对齐
，并在Bionano地图和使用Bionano软件包中使用脚本的脚本在Bionano package package-runcharacterize.py.py.py.py，runsv.py和allssv.py和al alalign_bnx______cmap._cmap.cm.cm.cm.cm.cm.cmc.cm.comc.cm.cm.comc.cm.cm compy consed bionano图和序列参考之间进行了差异。 　　使用单倍型感知参数组装了第二版
。该地图也与GRCH38和最终CHM13组件对齐 ，以验证杂合位置。然后进一步检查这些区域 。 　　对Bionano比对的分析表明
，位于CHR8：21,025,201，CHR8：80,044,843和CHR8：121,388,618的8号染色体中的三个杂合位点（补充表7）
。选择了最大的ONT读取支持的结构将其包含在8号染色体组件中（补充表7）。 　　我们通过应用TandeMmapper和TandeMquast52（https://github.com/ablab/tandemtools; 2020年3月20日的版本）评估了CHM13和NHP CentroMeric HOR阵列的结构 ，从而可以检测到重复阵列中的大型结构组件错误 。对于CHM13 CentroMere
，我们首先对ONT对齐50 kb的读数超过50 kb，与winnowmap43（v.1.0）的连续染色体8（v.1.0）的CHM13组件读取 ，并提取的读取与CentroMeric HOR阵列（CHR8：4424242424243868 -– 4663238585）保持一致
。然后
，我们在以下串联命令中输入这些读取：tandemquast.py -t -t 24 -nano {ont_reads.fa} -o {out_dir} chr8.fa.对于NHP Centromeres，我们对齐ONT读取与包含WinnowMap43（v.1.0）的连续染色体8 Centromeres的整个基因组组件 ，并提取的读取与CentroMeric HOR阵列保持一致。然后，我们在以下串联命令中输入这些读取：tandemquast.py-t 24 -nano {ont_reads.fa} -o {out_dir} chr8.fa. 　　使用nanopolish18（v.0.12.5）来测量通过winnowmap43（v.1.0）对齐与全基因组组件对齐的原始ONT读数（CHM13的长度> 50 kb）的CpG甲基化频率 。Nanopolish通过隐藏的Markov
，模型（HMM）在原始纳米孔电流信号上区分了5-甲基环胞嘧啶与未甲基化的胞嘧啶
。甲基化调用者在特定的K-MER处产生甲基化与未甲基化CPG的概率之比的对数似然值。我们使用nanopore_methylation_utilities工具（https://github.com/isacle/nanopore/nanopore-methylation-utilities）过滤了甲基化调用，该截止比例为2.5作为调用甲基化的阈值 。对数可能比率大于2.5（甲基化）或小于-2.5（未甲基化）的CPG位点被认为是高质量的 ，并包括在分析中
。没有任何高质量CPG位点的读取从BAM过滤
，以进行随后的甲基化分析。nanopore_methylation_utilities将甲基化信息集成到BAM文件中以在IGV54 Bisulfite模式下查看，该模式用于可视化CpG甲基化 。 　　使用RNeasy试剂盒（Qiagen; 74104）从大约1×107 CHM13细胞中纯化RNA ，并按照标准协议55制备为ISO-SEQ库中。将文库加载在两个SMRT细胞上8M上
，并在续集II上进行测序
。数据是通过ISOSEQ3（v.8.0）处理的，最终生成3,576,198个全长的非核读数。将Poly-A修剪的转录本与此CHM13 CHR8组装对齐 ，并使用miniMAP244（v.2.17-R941）与GRCH38对齐
，具有以下参数：-ax Splice -F 1000 -f 1000 -sam-sam-hit-hit-hit-hit-hit-sem-secondary -secondary = no -eqx 。使用Gencode57（v.34）注释的TrafureCounts56将笔录分配给基因，并补充了Gencode中未经宣布的任何成绩单的国际象棋v.2.258
。为每个成绩单对每个组件的比对的百分比标识进行评分 ，需要每个成绩单的90％以与组件保持一致
，才能将其计算为对齐。对于每个基因，将非CHM13转录本对GRCH38的百分比身份与CHM13染色体组件进行了比较 。在CHM13组件中具有改善表示的基因鉴定为每个基因的截止值的截止值提高了20个 ，其平均百分比身份的平均水平至少提高了0.2％
。使用Fiffoff59将Gencode（v.34）转录本提起到CHM13 CHR8组件，以将GRCH38注释与该组件和ISO-SEQ转录本进行比较。 　　我们将360万个全长转录数据（上图）与20,937,742个全长非巧克力公共可用的人类ISO-SEQ数据（补充表8）相结合 。总的来说
，我们比较了来自13个组织和细胞系源的24,513,940个全长的非核读数的比较与已完成的CHM13染色体8组件和当前人类参考基因组GRCH38的比较
。在848,048个非CHM13细胞系转录物中，与8
、93,495（11.02％）保持一致的染色体转录本与CHM13组件的百分比相同至少0.1％ ，而52,821（6.23％）与GRCH38保持一致。该指标表明
，尽管大多数变化本质上是微妙的，但第8号染色体参考将人类基因注释提高了约4.79％ 。总体而言 ，与GRCH38相比
，61个蛋白质编码和33个非编码基因座与CHM13组件的比对有所改善，平均百分比> 0.2％ ，平均百分比率提高了
，至少有20个支持转录本（扩展数据图3A-C，补充表1）
。例如 ，WDYHV1（也称为NTAQ1）具有四个氨基酸替代品
，13个转录本与CHM13共享相同的开放阅读框架（扩展数据图3D）。 　　为了生成成对序列的身份热图，我们将中心粒组件分成5 kb的片段（例如 ，1-5,000、5,001–10,000，等等）
，并使用以下minimap244（v.2.17-r941命令：minimap2 -f 0.0001-ta-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-32-4从对齐的雪茄串确定序列身份，然后使用r（v.1.1.383）60中的ggplot2（geom_raster）进行可视化 。每个段的颜色是通过通过身份进行排序的 ，然后创建10个同等大小的垃圾箱来确定的
，每个垃圾箱都从光谱托盘中获得了独特的颜色。在测试各种窗口尺寸之后，选择了一个5 kb窗口
。最终 ，我们发现5 kb是图形的分辨率（因为每个5 kb片段被绘制为像素）和minimap2的敏感性（小于5 kb的片段通常错过与AVA-the Ava-trest的比对）。图3中显示了说明此过程的示意图 。 　　为了比较CHM13和GRCH38β-防御素基因座的组织和方向
，我们将两个β-防御素区域保持一致（CHM13 CHR8：6300000–13300000; GRCH38 CHR8：6545299-1303398）与彼此之间的彼此之间的范围 - 使用以下ASSIMAP24444444444444444444444444444444444
。0.01 -n 1000 -CS {grch38_defensin.fasta} {CHM13_DEFENSIN.FASTA}。然后，我们应用了Miropeats61的版本 ，该版本经过修改以使用MiniMAP244对齐（https://github.com/mrvollger/minimiro）来产生显示两个序列之间同源性的图 。 　　为了确定CHM13染色体8 Centromeric区域的组织
，我们使用了两种独立的方法
。首先，我们对CHM13 Centromere组装进行了硅限制酶消化 ，其中在组装中确定了一组限制酶识别位点。与以前的发现一致
，即XBAI消化可以在8 HOR Array9中产生HORS的模式，我们发现可以通过XBAI消化提取每种α-卫星 。在硅消化分析中表明 ，染色体8 centromeric HOR阵列由1,462个HOR单位组成：283 4个4个学位群，4个5-MONOMENER HOSS
，13 6-MONSOMER HOSS，356 7-单体群 ，295 8个单体群
，295 8 MONOMONER SORMER，295 8 MONOMONER MORS ，和511 11 MMONSERS MORSERS MORS
。作为另一种方法
，我们使用一组从镀铬物8 11-Mer Hor单元中得出的11个α-Satellite单体，将Centromere组装对弦乐集成42（https://github.com/ablab/stringdecomposers; 2020年2月28日）使用。所使用的α-卫星单体的序列如下：A：agcattctcagaaaccttcgtgtgtgttgcaattgcaatcaagtcacagagtcacagagttgaacttccgttcgtttcattcattcagagagagaggaggtggtggaaacactcttattgtagtagtatctggaagtggacatttggcgctttcaggcctatggtggtggaaaaaaaaggaaaagaaatattcttcccataaaaaaaaacgacataga;B: AGCTATCTCAGGAACTTGTTTATGATGCATCTAATCAACTAACAGTGTTGAACCTTTGTACTGACAG AGCACTTTGAAACACTCTTTTTTGGAATCTGCAAGTGGATATTTGGATCGCTTTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGATGCAATATAAAACGTACACAGC;C: AGCATACTCAGAAAATACTTTGCCATATTTCCATTCAAGTCACAGAGTGGAACATTCCCATTCATAGAGCAGGTTGGAAACACTCTTTTTGGAGTATCTGGAAGTGGACATTTGGAGCGCTTTCTGAACTATGGTGAAAAAGGAAATATCTTCCAATGAAAACAAGACAGA;D: AGCATTCTGAGAAACTTATTTGTGATGTGTGTCCTCAACAAACGGACTTGAACCTTTCGTTTCATGCAGTACTTCTGGAACACTCTTTTT GAAGATTCTGCATGCGGATATTTGGATAGCTTTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGCTTACATGTAAAAATTAGACAGC;E: AGCATTCTCAGAAACTTCTTTGTGGTG TCTGCATTCAAGTCACAGAATTGAACTTCTCCTCACATAGAGCAGTTGTGCAGCACTCTATTTGTAGTATCTGGAAGTGGACATTTGGAGGGCTTTGTAGCCTATCTGGAAAAAGGAAATATCTTCCCATGAATGCGAGATAGA; F: AGTAATCTCAGAAACATGTTTATGCTGTATCTACTCAACTAACTGTGCTGAACATTTCTATTGATAGAGCAGTTTTGAGACCCTCTTCTTTTGGAATCTGCAAGTGGATATTTGGATAGATTTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGATTATATATAAAAAGTAGACAGC;G: AGCATTCTCAGAAACTTCTTTGTGATGTTTGCATCCAGCTCTCAGAGTTGAACATTCCCTTTCATAGAGTAGGTTTGAAACCCTCTTTTTATAGTGTCTGGAAGCGGGCATTTGGAGCGCTTTCAGGCCTATGCTGAAAAAGGAAATATCTACATATAGAAACTAGACAGA;H: AGCATTCTGAGAATCAAGTTTGTGATGTGGGTACTCAACTAACAGTGTTGATCCATTCTTTTGATACAGCAGTTTTGAACCACACTTTTTGTAGAATCTGCAAGTGGATATTTGGATAGCTGTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGAATGTCTTCATAGAAAATTTAGACAGA;I: AGCATTCTCAGAACCTTGATTGTGATGTGTGTTCTCCACTAACAGAGTTGAACCTTTCTTTTGACAGAACTGTTCTGAAACATTCTTTTTATAGAATCTGGAAGTGGATATTTGGAAAGCTTTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGAATATCTTCAAATAAAATCTAGCCAGA;J: AGCATTCTAAGAAACATCTTAGGGATGTTTACATTCAAGTCACAGAGTTGAACATTCC CTTTCACAGAGCAGGTTTGAAACAATCTTCTCGTACTATCTGGCAGTGGACATTTTGAGCTCTTTGGGGCCTATGCTGAAAAAGGAAATATCTTCCGACAAAAACTAGTCAGA;K: AGCATTCGCAGAATCCCGTTTGTGATGTGTGCACTCAACTGTCAGAATTGAACCTTGGTTTGGAGAGAGCACTTTTGAAACACACT TTTTGTAGAATCTGCAGGTGGATATTTGGCT AGCTTTGAGGATTTCGTTGGAAACGGTAATGTCTTCAAAGAAAATCTAGACAGA. 　　This analysis indicated that the CHM13 chromosome 8 centromeric HOR array consists of 1,515 HOR units: 286 4-monomer HORs, 12 6-monomer HORs, 366 7-monomer HORs, 303 8-monomer HORs, 3 10-monomer HORs, 539 11-monomer HORs, 2 12-monomer HORs, 2 13-monomer HORs, 1 17-monomer HOR, and 1 18-monomer HOR, which is concordant with the in硅限制酶消化结果 。StringDecomposer42中的主要HOR类型在图8中介绍
。 　　为了估计人类谱系中8q21.2 VNTR和DEFB基因座的拷贝数 ，我们将基于读取深度的副本编号Genotyper14应用于1,105个已发表的高覆盖基因组62,63,63,64,65,65,66667。简而言之
，将测序读数分为36个学位群的倍数，然后使用MRSFAST68（v.3.4.1）映射到重复掩盖的人类参考基因组（GRCH38） 。为了提高映射敏感性 ，我们最多可以每36个工程师HOR匹配两个不匹配。校正了基因组跨基因组的可映射序列的读取深度
，用于基本的GC含量，并且通过汇总每个样品的所有可映射基础 ，计算了感兴趣源的拷贝数估计
。 　　为了定义CencerRomeric HOR数组中混合的增加区域，我们使用在整个数组上的10单位窗口（1个单位载玻片）中不同HOR单元的频率计算了熵。以下公式用于确定熵： 　　在10个单位的窗口中
，在哪个频率为：（No 。该分析类似于先前执行的69
。 　　在CHM13基因组DNA上进行了液滴数字PCR，以估计D8Z2α-卫星HORS的数量 ，就像以前对DXZ1α-卫星Hors13所做的那样。简而言之
，使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）从CHM13细胞中分离基因组DNA 。使用量子荧光计和Qubit DsDNA HS分析（Invitrogen）对DNA进行定量
。用0.1 ng的GDNA用于D8Z2测定法或MTUS1单拷贝基因（作为对照）的GDNA或1 ng的GDNA，制备反应（20μl）。根据制造商的协议 ，将EVAGREEN液滴数字PCR（Bio-Rad）同时为D8Z2和MTUS1反应制备
，然后将其孵育15分钟以允许限制摘要 。 　　在琼脂塞中制备CHM13基因组DNA，并用BAMHI或MFEI（表征染色体8 Centromeric区域）或BMGBI（表征制造商推荐的缓冲液中的染色体8q21.2区域）
。用厨师映射器系统（Bio-Rad; Autopram ，5-850-KB范围
，16 h Run）分离消化的DNA，转移到膜（Amersham Hybond-N+） ，并用针对8 Centromeric sectromericα-Centromericα-Satellite或8Q221.2区域的156 bp探测器（156 bp探测）。The probe was labelled with 32P by PCR-amplifying a synthetic DNA template 233: 5′-TTTGTGGAAGTGGACATTTCGCTTTGTAGCCTATCTGGAAAAAGGAAATATCTTCCCATGAATGCGAGATAGAAGTAATCTCAGAAacatgttttattatgctgtatctactactaactaactgtgctgaAcatttctattgtaTaTaTaaaaaaaaAatagacagaagcatt-3'（对于8号染色体的刻粒）；264: 5′-TTTGTGGAAGTGGACATTTCG CCCGAGGGGCCGCGGCAGGGATTCCGGGGGACCGGGAGTGGGGGGTTGGGGTTACTCTTGGCTTTTTGCCCTCTCCTGCCGCCGGCTGCTCCAGTTTCTTTCGCTTTGCGGCGAGGTGGTAAAAATAGACAGAAGCATT-3′ (for the染色体8q21.2基因座的组织）具有PCR引物129：5'-TTTGTGGAAGTGGACATTTC-3'和130：5'-AATGCTTCTGTCTTCTATTTTTA-3' 。将印迹在65°C下孵育2小时
，以在教堂的缓冲液中预先杂交（0.5 m Na-磷酸盐缓冲液含有7％SDS和100μgml-1的未标记鲑鱼精子载体DNA）
。将标记的探针在沸水浴中进行热变性5分钟，然后在冰上冷却。将探针添加到杂交教堂的缓冲液中 ，并在65°C下杂交48小时 。The blot was washed twice in 2× SSC (300 mM NaCl, 30 mM sodium citrate, pH 7.0), 0.05% SDS for 10 min at room temperature, twice in 2× SSC, 0.05% SDS for 5 min at 60 °C, twice in 0.5× SSC, 0.05% SDS for 5 min at 60 °C, and twice in 0.25× SSC, 0.05% SDS在60°C下5分钟。在-80°C下将印迹暴露于X射线膜中16小时
。补充图9中显示了所有凝胶和印迹的未经处理，未加工的图像。 　　为了验证8染色体8丝粒的组织
，我们在中期染色体上进行了鱼类，如前所述70 ，并进行了轻微的修饰 。简而言之
，将CHM13细胞用Colcemid处理，并重悬于HCM缓冲液中（10 mM HEPES PH7.3 ，30 mM甘油
，1 mM CaCl2，MM MMGCL2）
。10分钟后 ，用甲醇固定细胞：乙酸（3：1）
，滴入先前干净的载玻片上，并浸泡在1×PBS中。将载玻片在冷甲醇中孵育过夜 ，并在68°C下与标记的鱼探针杂交2分钟
，并在37°C下孵育过夜 。将载玻片在65°C的0.1×SSC中洗涤3次，每次将载玻片安装在含有5μgml -1 DAPI的Vectashield之前
。在配备有电荷耦合的设备摄像头（CoolsNAP HQ2）和100×1.6-0.6 Na物镜的荧光显微镜（Leica DM RXA2）上成像载玻片。使用Leica Application Suite X收集图像（v.3.7） 。 　　从人类的大型插入克隆fosmid库ABC10中挑选出用于验证8个染色体丝粒组织的探针
。使用Megablast（相似性= 0.99 ，参数：-d 2 -v 7 -b 7 -e 1e -40 -40 -p 80 -p 80 -p 80 -p 80 -w 12 -t 21 -f F）映射ABC10末端序列，以重复掩盖的CHM13基因组组件
，其中包含8个完整的镀铬物（参数： -FOSMID的预期插入尺寸设置为（最小）32 kb和（最大）48 kb。根据给定的克隆的比对，对齐对准 ，对齐取向以及从组件的推断插入大小
，将所得的克隆对齐分为以下类别 。（1）最佳：克隆对的独特对齐，在预期的fosmid范围内插入大小 ，预期方向
。（2）一致的绑定：克隆对的非唯一比对
，在预期的fosmid范围内插入大小，预期方向。（3）不一致的：克隆对的独特对准 ，插入尺寸太小
，太大或预期的fosmid克隆方向相反 。（4）不一致的绑定：克隆对的非独特对准，插入太小 ，太大或预期的fosmid克隆的预期方向。（5）不一致的反式：克隆对具有末端映射到不同的重叠群
。 　　选择了与8中心染色体区域内的区域排列的克隆以进行鱼类验证。The fosmid clones used for validation of the chromosome 8 centromeric region are: 174552_ABC10_2_1_000046302400_C7 for the p-arm monomeric α-satellite region (Cy5; blue), 174222_ABC10_2_1_000044375100_H13 for the p-arm portion of the D8Z2 HOR array（Fluorx; Green）
，171417_ABC10_2_000045531400_M19，用于D8Z2 HOR Array（CY3; RED）的中央部分 ，173650_ABC10_2_2_1_1_0000444444444508400_J14，用于D8Z2 Horay Aray Q-Arn;173650_ABC10_2_1_000044091500_K11用于Q-ARM单体α-卫星区域（CY5; Blue） 。 　　为了确定CENP-A相对于甲基化DNA的位置（特定于5-甲基环肽）
，我们在拉伸的CHM13染色质纤维上进行了免疫荧光，如前所述的71,72进行了修饰
。简而言之 ，CHM13细胞在低音缓冲液中肿胀
，该低音缓冲液由1：1：1的比率为75 mm KCl，0.8％柠檬酸钠和DH2O 5分钟。然后 ，将3.5×104个细胞在55g时用shandon Cytospin 4在乙醇洗涤的载玻片上进行
，持续4分钟，并高加速度 ，然后粘附1分钟
，然后浸入盐含量 - 尿素裂解缓冲液中（25 mm Tris pH 7.5，0.5 m nacl ，0.5 m nacl
，1％triton x-1％x-15 mil x-1和0.3 m urea），以适用于15 min和0.3 m urea和0.3 m urea） ，以适用于0.3 m urea和0.3 m urea），以适用于15 m urea） 。在38 s的时间内从裂解缓冲液中缓慢去除载玻片
，然后在PBS中洗涤，在4％甲醛中在PBS中孵育10分钟 ，并用PBS和0.1％Triton X-100洗涤
。将载玻片在PBS中冲洗掉在PBS和0.05％的Tween-20（PBST）中3分钟
，用免疫荧光块（2％FBS，2％BSA ，0.1％BSA
，0.1％Tween-20和0.02％NAN2）阻塞30分钟，然后与小鼠单连环抗Cenp-A抗体（1：1：1：1：1：1.200 ，ENE）和200次抗性（在室温下
，单克隆抗5-甲基环胞嘧啶抗体（1：200，REVMAB ，RM231）。将细胞在PBST中每次洗涤3次
，然后在Alexa Fluor 488山羊抗兔（1：200，Thermo Fisher Scientific ，A-111034）和Alexa Fluor 594与山羊抗小鼠（1：200，Thermo Fisher Scientific
，A-111005）孵育594 。将细胞在PBST中每次洗涤3次，持续5分钟 ，在4％甲醛中固定10分钟
，并在DH2O中洗涤3次1分钟，然后将其安装在含有5μgml -1 Dapi的Vectashield
。在配备有电荷耦合器件摄像头（Leica DFC365 FX）和40×1.4 NA物镜的倒置荧光显微镜（Leica DMI6000）上成像载玻片。 　　为了评估8q21 Neocentromere的重复组织 ，我们在CHM13染色质纤维上进行了FISH73 。亨利·H·汉（Henry H.简而言之
，用甲醇：乙酸（3：1）固定染色体，滴入以前清洁的载玻片上 ，并浸泡在1×PBS中
。通过NaOH：乙醇（5：2）溶液中的Coverslip进行手动伸长。将载玻片安装在含有5μgml-1 DAPI的Vectashield中
，并在配备有电荷耦合的设备摄像头（CoolSNAP HQ2）和100×1.6-0.6 Na物镜的荧光显微镜（Leica DM RXA2）上成像 。用于验证8q21.2基因座的探针是从上面描述的同一ABC10 fosmid库中挑选的，其中包括174552_ABC10_2_2_2_1_00000044787777700_O7 ，用于探针1（CY3; RED）和173650_ABC10_ABC10_2_1_2_1_1_1_0044444086000_F24（流感）。成像了几种CHM13 8Q21.2染色质纤维
。我们使用ImageJ的凝胶分析工具（v.1.51）量化了一组CHM13染色质纤维上探针信号的数量和强度
，并发现有63±7.55个绿色信号和67±5.20红色信号（n = 3个独立实验），与67 Full和7 pottial extials Repote in Chm13 8Q 1一致。 　　如前所述 ，我们对CHM13细胞上的天然CENP-A CHIP-SEQ进行了两种独立的重复，如前所述25,72
，并进行了一些修改 。简而言之，收集了3×107–4×107个细胞 ，并重悬于2 ml冰冷的缓冲液I（0.32 m蔗糖
，15 mm Tris，pH 7.5 ，15 mm NaCl
，5 mM MGCL2，0.1 mM MGCL2 ，0.1 mm EGTA
，EGTA和2×HALT HALT蛋白酶蛋白酶抑制剂Cocktail（Hallt Protease Cocktail（Thermo Fisher 788429））
。冰冷的缓冲液II（2 mL； 0.32 m蔗糖，15 mM Tris ，pH 7.5
，15 mM NaCl，5 mM MGCL2 ，0.1 mM EGTA，0.1％igepal和2×Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒）
，将样品放在冰上10分钟。The resulting 4 ml of nuclei were gently layered on top of 8 ml of ice-cold buffer III (1.2 M sucrose, 60 mM KCl, 15 mM, Tris pH 7.5, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, and 2× Halt Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher 78429)) and centrifuged at 10,000g for 20 min at4°C 。将沉淀的核重悬于缓冲液A（0.34 m蔗糖，15 mM HEPES ，pH 7.4 、15 mM NaCl
，60 mM KCl，4 mM MGCL2和2×Halt Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒鸡尾酒鸡尾酒）中 ，至400 ng ml -1
。将核冷冻在干冰上
，并在80°C下储存。使用0.2-0.3uμg -1 MNase（Thermo Fisher 88216）在200-300μg染色质上对MNase消化反应进行了补充37°C的3 mm CaCl2的缓冲液中 。在冰上用10 mM EGTA淬灭反应，在4°C下以500g离心7分钟
。将染色质重悬于10 mM EDTA中 ，并在4°C旋转2小时。将混合物调节至500 mm NaCl
，在4°C下再旋转45分钟，然后在4°C下以最大速度（21,100G）离心5分钟 ，在上清液中产生消化的染色质 。将染色质用缓冲液B（20 mM Tris
，pH 8.0，5 mM EDTA ，500 mM NaCl和0.2％Tween 20）稀释至100 ng ML -1，并在4°C下用100μl50％G蛋白G Sepharose珠（GE Healthcare）浆液预先清除20分钟
，旋转20分钟
。保存清理的上清液（10–20μg块状核小体）进行进一步处理。到其余上清液，20μg小鼠单克隆抗Cenp-A抗体 （ENZO ADI-KAM-CC006-E）添加并在4°C下旋转过夜 。通过添加200 ml 50％蛋白G丝糖珠浆料 ，然后在4°C旋转3小时
，从而回收了免疫复合物。将珠子用缓冲液B洗涤3次，一次用缓冲液B洗涤 ，而无需补间
。对于输入分数
，添加了相等体积的输入恢复缓冲液（0.6 m NaCl，20 mM EDTA ，20 mM Tris
，pH 7.5和1％SDS）和1 mL RNase A（10 mg ML -1），然后在37°C下孵育1小时。然后加入蛋白酶K（100 mg mL -1 ，Roche）
，并在37°C下再孵育3小时 。对于芯片分数，将300μL的芯片回收缓冲液（20 mM Tris ，pH 7.5，20 mM EDTA
，0.5％SDS和500 mg ML -1蛋白酶K）直接添加到珠子中，并在56°C下孵育3-4 h
。将所得蛋白酶K处理的样品进行苯酚 - 氯仿提取 ，然后用Qiagen Minelute PCR纯化柱进行纯化。使用安捷伦生物分析仪仪器和2100高灵敏度试剂盒分析未放大的大量核小体和芯片DNA 。 　　使用Truseq芯片库制备套件制作了测序库
，该库将根据制造商的说明进行了一些修改，并根据制造商的说明进行了一些（Illumina IP-202-1012）
。简而言之 ，对5–10 ng块状核小体或芯片DNA进行了末端修复和A尾。将Illumina Truseq适配器连接
，使用e-Gel尺寸选择II琼脂糖凝胶，将库予以选择 ，以排除多核体
，并使用PCR聚合酶和套件中提供的PRCR聚合酶和引物鸡尾酒对库进行PCR放大 。使用NextSeq 500/550高输出套件v2.5（300个循环），将所得的库用于150 bp ，配对的光泽测序
。使用FASTQC（https://github.com/s-andrews/fastqc）评估了所得读数
，并用镰刀（https://github.com/najoshi/sickle; sickle; v1.33）修剪，以删除低质量5'和3''和3''和3'的基础 ，并用cutadapt75（v.1.18）（v.118）。 　　使用两种不同的方法将处理后的CENP-A芯片和大量核小体读数与CHM13全基因组组装5对齐：（1）BWA-MEM76（v.0.7.17）（V.0.7.17）和（2）我们开发的基于K-mer的映射方法（如下所述） 。 　　对于BWA -MEM映射，将数据与以下参数对齐：BWA MEM -K 50 -C 1000000 {index} {read1.fastq.gz}用于单端数据
，而BWA MEM -K 50 -C 50 -C 1000000 {index} {index} {read1.fastq.gz} {readq.gofq.gz} {使用SAMTools47和标志分数2308过滤所得的SAM文件，以防止读取的多映射
。使用此过滤器 ，读取映射到一个以上的位置被随机分配一个单个映射位置
，从而防止了高度相同区域的映射偏差。将8染色体的对准8中心的比对被缩减为相同的覆盖范围，并用DeepTools77（v.3.4.3）BamCompare标准化 ，带有以下参数：BamCompare -B1 {chip.bam} -b2 {bulk_nucleosomal.bam} - bulk_nucleosomal.bam} -opoperation-binsize-binsize 1000 000000000 {使用CHM13染色体8组件作为组装轮毂
，在UCSC基因组浏览器上可视化了所得的Bigwig文件 。 　　对于基于K-MER的映射，使用初始BWA-MEM比对来识别特定于染色体8 Centromeric区域的读取（CHR8：43600000–47200000）。使用水母（v.2.3.0）从每个染色体8 Centromere特异性数据集中鉴定出K-MER（K = 50） ，并将其映射到读取中
，染色体8 Centromere组装材料允许不匹配
。在D8Z2 HOR阵列中也发现了读数中所有K-MER的大约93-98％。然后，从读取数据中的每个K-MER都会在HOR阵列中的所有站点之间随机放置 ，与该K-MER具有完美匹配 。然后
，使用R Core Team，2020）使用1-KB垃圾箱的直方图对这些数据进行可视化
。 　　为了确定染色体8 centromeric hor阵列中短读数的可视性 ，我们进行了一个模拟，从而从CHM13 D8Z2 HOR阵列中从五个同等大小（416 kb）区域产生了300,000个随机150 bp片段。如上所述
，我们使用BWA-MEM（V0.7.17）或基于K-MER的方法将这些片段映射回CHM13染色体8 Centromeric区域 。对于BWA -MEM映射，将150 bp的片段与以下参数对齐：BWA MEM -K 50 -C 1000000 {index} {fragments.fasta}
。使用SAMTools47和标志分数2308过滤所得的SAM文件 ，以防止读取的多映射
，然后转换为BAM文件。BAM文件在IGV54中可视化 。对于基于K-MER的映射，使用水母（v.2.3.0）从每组150 bp片段中鉴定出K-MER（K = 50） ，并将其映射回这些片段和8个Collomosome 8 Centromere组装
，允许不匹配不匹配
。与centromeric区域内多个地点匹配的K-MER被随机分配给其中一个站点。使用R Core Team，2020）中使用1-KB仓的直方图可视化这些数据 。 　　为了评估α-瑞典重复序列之间的系统发育关系 ，我们首先使用retoceMasker78（v.4.1.0）掩盖了人和NHP Centromere组装中的每个非α-卫星重复
。然后
，我们使用源自源自染色体8 11个单位单元的11个α-瑞典单体单体（在“α-Satellite组织的分析 ”中描述的是上面的α-Satellite hor单元的11个α-卫星单体单体），将蒙面的组件对字符串Decosser42（2020年2月28日获得）进行了串联的组合物42（版本可用）。该工具将α-卫星单体在组件中的位置识别 ，我们用它从HOR/Dimeric阵列和单体区域提取α-卫星单体单体中的位置 。我们最终提取了12,989
、8,132、12224 、25,334和63,527α-satellite单体
，来自人类的Hor/dimeric阵列，黑猩猩（H1） ，黑猩猩（Chimpanzee），黑猩猩（H2）
，organutan and Macaque，分别分别来自人类 ，黑猩猩（H1）
，黑猩猩（H2），猩猩和猕猴的单体区域的单体。我们从HOR/二聚阵列和单体区域随机选择了100和50α-瑞典单体 ，并与MAFFT79,80（V.7.453）对齐
。我们使用IQ-Tree81通过模型选择和1000个引导程序重建最大样品系统发育。在Itol82中可视化了所得的树文件 。 　　To estimate sequence divergence along the pericentromeric regions, we first mapped each NHP centromere assembly to the CHM13 centromere assembly using minimap244 (v.2.17-r941) with the following parameters: -ax asm20 --eqx -Y -t 8 -r 500000. Then, we generated a BED file of 10 kb windows located within the CHM13 centromere assembly. We used the BED file to subset the BAM file, which was subsequently converted into a set of FASTA files. FASTA files contained at least 5 kb of orthologous sequences from one or more NHP centromere assemblies. Pairs of human and NHP orthologous sequences were realigned using MAFFT (v.7.453) and the following command: mafft --maxiterate 1000 --localpair. Sequence divergence was estimated using the Tamura-Nei substitution model83, which accounts for recurrent mutations and differences between transversions and transitions as well as within transitions. Mutation rate per segment was estimated using Kimura’s model of neutral evolution84. In brief, we modelled the estimated divergence (D) is a result of between-species substitutions and within-species polymorphisms; that is, D = 2μt + 4Neμ, in which Ne is the ancestral human effective population size, t is the divergence time for a given human–NHP pair, and μ is the mutation rate. We assumed a generation time of [20, 29] years and the following divergence times: human–macaque = [23 × 106, 25 × 106] years, human–orangutan = [12 × 106, 14 × 106] years, human–chimpanzee = [4 × 106, 6 × 106] years. To convert the genetic unit to a physical unit, our computation also assumes Ne = 10,000 and uniformly drawn values for the generation and divergence times. 　　Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this paper.