在组织再生过程中的代谢适应直接细胞命运

　　这项研究中的所有动物实验均根据纪念斯隆·凯特（Sloan Kettering）机构动物护理和使用委员会批准的方案进行（批准编号：11-06-012） 。在温度控制的房间（22±1°C）中 ，将小鼠在8:00至20:00之间的12小时光周期内容纳，并可以免费获得水和食物。在所有实验中
，雄性和雌性小鼠均以相等的比例使用
。没有观察到基于性别的差异。使用10-14周的小鼠进行实验 。基于先前的实验和已发表的研究确定样本量，以确保足够的能力检测与生物学相关的差异
。将小鼠随机分配给实验组。在可能的情况下 ，研究人员在数据收集和分析过程中对组分配视而不见 。 　　考虑到OGDH敲除是胚胎Lethal51
，我们使用与GFP报告基因相关的多西环素诱导的shRNA开发了一个可诱导的模型
。该系统可实现对OGDH表达的时间和可逆抑制，并促进使用GFP Reporter对OGDH敲低的细胞进行跟踪和分析。为了说明RNA干扰（RNAI）的潜在脱靶效应 ，我们使用了两个经过验证的SHRNA（Shogdh_2081和Shogdh_346）1 。作为对RNAi机械扰动的非序列效应的对照
，我们使用了一个包含肾小球 - 卢西酶靶向shRNA的类似构造（SHREN_731），该构建体（SHREN_731） ，该构建体并未靶向小鼠细胞中表达的任何基因
。SHRNA的指南链是：Renilla
，tagataagcattataattcct；OGDH_2081，TAAATGAAACATTTTGTCCTG;OGDH_346 ，tagcaattctgcatacttctg。将强力霉素诱导的GFP偶联的shRNA构建体进行电穿孔
，并在4482 ES细胞中的COL1A1基因座的“归巢盒”中整合到30,33的Col1a1基因座中；该盒子包含用CAG-RTTA启动子表达的强力霉素诱导的反向Tet反式激活器（RTTA-M2） 。经过验证的克隆用于使用八细胞聚集来生成嵌合小鼠，从而评估F0中的功能
。将最终的创始人反向交叉以建立种系传输 ，并产生TG。TRE-SHOGDH_2081，TG 。tre-shogdh_346和tg。TRE-SHRENILLA_731小鼠
。为了进一步扩大OGDH敲低并使TRE-GFP-shRNA盒的广泛表达
，包括在Intestine33中，我们用CAGS-RTTA3转基因小鼠越过Tre-shrenilla和Tre-shogdh小鼠 ，导致Tre-Shrenillacag-rtta3和Tre-Shog-Shog-Shog-Shogdhcagdhc-Rtthc-rtthc-rtthc-rtthc-rtthc-rttaM-rttaM-rttaM-rtthc-rttaM-rtthc-rttaMtta333333。 　　为了使LGR5+细胞分离以评估TCA循环酶的表达
，我们使用了LGR5-EGFP-IRES-CREERT2小鼠52 。 　　为了解决分泌池是否具有可塑性并可以对ISC进行推断，通过将ATOH1-CREERT2鼠标Model47与Rosa26-Cags-LSL-RIK53交叉而产生 ，该鼠标是loxp-flank-flank cassette cassette cassette cassette cassette上游的ROSA26-CAGS-cags-cags-rik53
，irtta3 ress sequence and Morred corecent froer 2GT（Rosa）26个基因座
。4-羟基莫昔芬的给药可导致Rik等位基因中停止盒的切除。因此，ATOH1+细胞及其后代将永久表达MKATE2 ，使其识别和表达ATOH1细胞命运的动态跟踪 。 　　为了产生人类炎症性肠病的啮齿动物模型
，我们在rag2 - / - 小鼠中使用了CD4+CD45RBHIGH诱导的结肠炎模型45
。简而言之，收集了10个C57BL/6雄小鼠的脾脏 ，砸碎
，通过40μm滤波器过滤，并用隔离缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS） ，0.5％牛血清白蛋白（BSA）（BSA）和2 mM EDTA和2 mm EDTA，pH 7.2）洗涤。然后将细胞离心（288G
，5分钟），并将所得的脾细胞颗粒重悬于ACK缓冲液（质量生物学 ，118-156-101C）中
，以裂解红细胞 。细胞计数后，按照制造商的说明 ，使用CD4+分离试剂盒（Miltenyi
，130-104-454）分离CD4+细胞
。将脾细胞转移到荧光激活的细胞分选（FACS）缓冲液（0.5％BSA和2 mM EDTA中，Ca2+/mg2+-fre-free PBS） ，并在ICE上与抗CD4-APC孵育30分钟（Biolegend
，Biolegend，116014 ，116014
，Clone Rm4-4-4-4-4-4，1：1：1：1：1：1：2004）。103306 ，克隆C363-16A，1：200）抗体 。然后使用Sony MA900细胞分选仪对CD4+CD45RBHIGH和CD4+CD45RBLOW细胞进行分类
。最后
，将0.5×106的细胞腹膜内注射到rag2 - / - 雄性小鼠中，并在接下来的三个月内发育。 　　CAG-RTTA3介导Shrenilla和Shogdh表达通过成人阶段的强力霉素饮食（200 mg kg-1）喂养小鼠 ，从而激活了CAG-RTTA3 。食物每周更换两次。 　　如前所述进行急性DSS处理
。43。简而言之
，在十周龄时，用2％DSS（MP-BioMedicals ，021160110-CF）在饮用水中用小鼠治疗五天 。之后
，将水更改为常规饮用水，并在指定的时间点安乐死
。在使用DSS模型的所有实验中 ，在DSS治疗开始时和此后每隔一天都称量小鼠。此外
，每天都会对它们进行遇险或终点标准的迹象进行评估 。具体而言，如果小鼠损失了超过20％的初始体重或表现出呼吸困难 ，就会立即对他们进行安乐死
。 　　对于溴脱氧尿苷（BRDU）脉冲实验
，将小鼠在PBS中注射1 mg的BRDU（Sigma-Aldrich），并在两个小时后安乐死。 　　为了补充DM-αkg ，每天用600 mg kg-1或300 mg kg-1的DM-αkg（349631-5G，Sigma-Aldrich）注入（腹膜内）一次 。对于车辆控制
，将小鼠注入PBS
。 　　为了抑制OGDH，每天连续三天的循环中 ，每天将一次腹膜内注射小鼠（2.5 mg kg-kg-1
，Sigma-Aldrich，D9891 ，D9891）一次。 　　如所述54进行DM-二酸治疗 。总而言之
，在整个实验过程中，在饮用水中为小鼠提供了100 mM DM二糖（W239607-1KG-K ，Sigma-Aldrich）
，并在整个实验过程中每隔一天接受每隔100 mM DM糖的腹膜内注射
。对于饮用水和注射剂，将pH调节为6.5。 　　对于ATOH1-CREERT2； RIK小鼠的脉冲练习标记实验 ，每隔一天通过口服宣传每天进行5毫克的他莫昔芬（T5648-1
，Sigma-Aldrich），总计五天 。 　　对于糖酵解抑制 ，将小鼠用腹膜内注射500 mg kg-1的2-脱氧葡萄糖（Sigma，111980050）每周五次
，持续一个月。 　　从小鼠尾部和耳孔中提取基因组DNA
。在补充10％Triton X-100 、1％2-甲醇和0.4 mg ML-1蛋白酶K的MGB缓冲液中消化活检（Qiagen，19133） ，并在55°C下孵育过夜。PCR条件为95°C 6分钟
，然后是35个周期（95°C 40 s，62°C 45 s ，72°C
，持续1分钟），然后72°C持续10分钟 。PCR扩增产生了一个300 bp的突变等位基因（表明成功的shRNA整合）和野生型等位基因的218 bp带
。 　　使用Rneasy套件（Qiagen ，74004）
，从从TRE-shrenillacag-rtta3，Tre-shogdhcag-rtta3 ，媒介物处理或DM-αkg处理的小鼠中分离出总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪评估RNA浓度和质量 。测序和图书馆的制备是在纪念斯隆氏菌癌症中心（MSKCC）的综合基因组学操作中进行的
。从总RNA制备RNA-Seq库。在敏捷生物分析仪的核糖定量和质量控制之后
，根据Illumina提供的指令（Truseq绞合的mRNA LT KIT，RS-122-2102）进行了100-500 ng的总RNA和TRUSEQ库制备 ，并进行了八个PCR循环 。将样品在50 bp/50 bp配对端运行中在HISEQ 4000或HISEQ 2500上运行，并使用MSKCC集成基因组学操作的HISEQ 3000/4000 SBS KIT或TRUSEQ SBS KIT V4（ILLUMINA）使用HISEQ 3000/4000 SBS KIT或TRUSEQ SBS KIT V4（ILLUMINA）
。每个样品平均生成4100万个配对读数。核糖体读数最多代表产生的总读数的0.01％
，而mRNA的比例平均为53％ 。 　　使用Trimmomatic55从RNA-seq数据中删除适配器序列
。然后，使用Star56将修剪的读数与GRCM38.91（MM10）参考基因组对齐 ，并使用farmaturecounts57量化了转录本数以生成原始计数矩阵。比较了实验条件
，使用r（http://cran.r-project.org/）中的DESEQ2 package58进行差异基因表达分析 。每种情况都有三到五个独立的生物学重复（单个小鼠）。使用DESEQ2进行PCA，以可视化样品中基因表达的变化
。根据PADJ的基因表达大于双重变化 ，鉴定出差异表达的基因（DEG）< 0.05. To visualize the DEGs, the samples were z-score normalized and plotted as a heat map using the ‘pheatmap’ package in R. Functional annotations of the gene sets were done by pathway enrichment analysis using the Reactome, Azimut, CellType and KEGG databases. The analysis was performed with enrichR59, and the significance of the tests was assessed using a combined score, calculated as log(P) × z, where P represents the P value from the Fisher exact test, and z is the z-score indicating the deviation from the expected rank. Gene set enrichment analysis (GSEA)60 was done using the GSEA-Preranked tool (v.2.07). The analysis involved the enrichment of gene sets using RNA-seq data obtained from the experiment. The gene sets were derived from the MSigDB database (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb), as well as previously published signatures from mouse intestine. 　　Data were obtained from a previously published study26,27,28. In brief, human intestines were collected from three male donors (aged 29, 45 and 53 years) through HonorBridge (formerly Carolina Donor Services). Donors met eligibility criteria, including the absence of infectious diseases, cancer or recent abdominal surgeries. Intestinal tissues were divided into six regions: duodenum, jejunum, ileum and the ascending, transverse and descending colon. Mucosectomies (3 × 3 cm) were taken from the centre of each region. Sample preparation and cell hashing were performed as described using the reported cell classification and anatomical location26,27,28. Raw and normalized data, along with cell annotations, were obtained from a published study and downloaded from GSE185224. Seurat60,61,62,63 was used to perform the scRNA-seq data analysis, and the.h5ad file was converted into a Seurat object using the R package zellkonverter. The GetAssayData function was used to extract Ogdh expression, and the AverageExpression function was used to calculate the average expression across different regions or lineages. The TCA-cycle gene set was generated using the genes from the TCA-cycle enzymes, and the gene signature score was computed using the AddModuleScore function from Seurat. Gene signatures used in the paper are shown in Supplementary Table 8. 　　For qPCR with reverse transcription (qRT–PCR) analysis, total RNA was extracted from mouse ES cells, isolated crypts or sorted cells from Lgr5-EGFP mice using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN, 74004). Subsequently, cDNA synthesis was performed using TaqMan reverse transcription reagents (Applied Biosystems). qPCR was performed in triplicate using SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) on the ViiA 7 Real-Time PCR System (Invitrogen). The expression levels of target genes were normalized to endogenous control genes, Rplp0 (also known as 36B4) and Actb. Gene-specific primer sets were designed using the qPrimerDepot tool provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) or published elsewhere. For primer sequences and details, see Supplementary Table 2. 　　To quantify 5mC and 5hmC at SPDEF-specific loci, we used the BisulPlus Loci 5mC & 5hmC Detection PCR Kit (P-1067-48), following the manufacturer’s protocol. For DNA extraction and bisulfite conversion:, genomic DNA was extracted from intestinal crypts using the Zymo Research Quick-DNA Miniprep Plus Kit (D4069) and quantified with a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). For each reaction, 500 ng genomic DNA was subjected to bisulfite conversion to deaminate cytosines while preserving 5mC and 5hmC. The conversion was performed according to the manufacturer’s guidelines. For primer design, primers for bisulfite-converted DNA were designed using MethPrimer (https://methprimer.com/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi/) (Supplementary Table 7). The primer design avoided CpG dinucleotides to minimize bias between methylated and unmethylated DNA. Primers were 26–35 bases long to ensure specificity, with melting temperatures (Tm) adjusted to higher than 60 °C through guanine-rich sequences. Each primer set amplified one strand of the bisulfite-converted DNA. For PCR amplification and detection of 5mC and 5hmC, after bisulfite treatment, the targeted loci were amplified in a 50-µl PCR reaction containing 25 µl of 2× Master Mix, 2 µl of bisulfite-converted DNA, 1 µl of each primer (10 µM) and nuclease-free water. The thermal cycling conditions were: initial denaturation: 95 °C for 5 min; 35 cycles of 95 °C for 30 s (annealing temperature specific to primers) and 72 °C for 1 min; final extension: 72 °C for 5 min. For normalization of 5hmC levels: to accurately quantify 5hmC, PCR signals from the 5hmC-specific reactions were normalized against the total methylation (5mC + 5hmC) at each locus. The percentage of 5hmC was calculated using the following formula: 5hmC (%) = 100 × (5hmC signal/(5mC signal + 5hmC signal)). 　　For qPCR, the Ct values of the 5mC- and 5hmC-specific reactions were compared, and the relative levels of 5hmC were obtained using the ΔCt method. The difference between Ct values (ΔCt) provided an estimate of relative hydroxymethylation, and the fold change was calculated using the formula 2−ΔCt2. 　　For plasmid maps and shRNA sequences, see Supplementary Table 6. 　　The lentiviral vector used to silence Hnf4a and Hnf4g, pLV[2miR30]-Hygro-TRE3G>MCHERRY：{shhnf4a}：{shhnf4g}
，其控制矢量PLV [2mir30] -Hygro-tre3g> MCHERRY：SCRAMBLE [mir30-shrna＃1]：Scramble [mir30-shrna＃2]，由vectorbuilder构建和包装。这些是串联shRNA表达载体 ，每个表达载体都携带两个shRNA序列
，设计为在相同的调节元件下共表达，从而同时敲低两个靶基因 ，或者在对照的情况下
，可以同时敲低两个非目标的争夺序列 。向量ID分别为VB231003-1530DWR（SHCONTROL VECTOR）和VB231003-1530SRJ（HNF4A和HNF4G矢量）
。这些ID可用于检索有关质粒的特定信息。shhnf4a：tactattttttaCctacctatggg;shhnf4g：ttaatatttatgtgtcagtgctgg;shrenilla：acctaaggttaagtcgccctcg（×2串联序列） 。 　　记者向量用于研究HNF4家族在OGDH表达中的作用，PRP [pro] -hrluc/puro- {ogdh_promoter_wt}> turbogfp和prp [prp [pro] -hrluc/puro- {ogdh_promoter_hhnf4aaa wasterbionbiond>向量ID分别为VB231003-1479YAB和VB231003-1483KBD
。野生型OGDH启动子：AACAAGTGTTCAAAAATCATCATCATGTTATTCAAATTTTTGTGCAGGGGGGATACATTTACCACCCACCACTATTATTATTATTATTAGGGCTTGTTTTTTTTTTGGATACaaagccccgtgggcctcaaagtcgcgcgctcctgcttcgccgcccgcccagccaaacgcttcaattaatcagcaggcaggcacgcacgccccccccccctgaatgtaccaggttcttaacaagcttcggaagcgtctcccgtgtaactgctaatgacagccaagccaaagacagtgagaagcaagcaaggctgctttggcccagcagcagcagccagcaagttctgcattgcattgcgcgaagcccgagcgagcgactgaaacccaatccaattctgtgtcacgtcacgccacgccacagcctgtcttgcaggcaggccgccgctcctctctgggggggcggcgcgcgcgcgctacgcgcgttgacgcc。突变的OGDH启动子：AACAAGTGTTCAAAAATCATCATCATGTTATTCAAATTTTTGTGCAGGGGGGATACATTTACCACCCACCACTATTATTATTATTATTAGGGCTTGTTTTTTTTTTGGATACaaagccccgtgggcctcaaagtcgcgcgctcctgcttcgccgcccgcccagccaaacgcttcaattaatcagcaggcaggcacgcacgccccccccccctgaatgtaccaggttcttaacaagcttcggaagcgtctcccgtgtaactgctaatgaccagccagccaaagacagtgagaagcaagcaaggctgggtgggctggctagctagctggcgcgcgcgctgcattgcattggcgcgcgaagcccgagcgcgactgaaacccaatccaattctgtgtcacgtcacgccacgcccacagcctgtcttgcaggcaggccgccgctcctctctggggggcggcgcgcgcgcgctacgcgcgcgttgacgcc 。 　　从小鼠中除去小肠和结肠 ，并用PBS冲洗
。然后，在室温下在10％的福尔马林中孵化肠道
，“瑞士滚动 ”纵向打开，变为70％乙醇 ，并加工为石蜡嵌入。 　　从C57BL/6的新鲜解剖的小肠子中
，分离出DuodeNum（距胃的前10-12厘米），Tre-shogdhcag-rtta3和tre-shrencag-rtta3小鼠 ，因为它在较短的时间内会产生更多的隐窝 。将十二指肠纵向通过管腔打开
，然后在冰冷的汉克斯平衡盐溶液（HBS）中洗涤，直到收集其余样品
。接下来 ，将十二指肠转移到15毫升猎鹰管中
，然后切成1-2厘米的碎片。对于每个管，在HBSS中添加了6-7毫升冰冷的8 mM EDTA ，并将管在冰上孵育15分钟 。孵育后
，除去EDTA溶液并用HBS代替。然后将管子剧烈摇动约20 s
。从上清液中取一个20μl等分试样，并在显微镜下检查 ，以确认其含有绒毛馏分。将上清液丢弃，然后将肠片转移到新的15毫升猎鹰管中
，然后用冰冷的HBS冲洗，以去除任何残留的绒毛 。每个管中添加了HBSS中另外6–7毫升的冰冷8 mM EDTA ，然后在冰上孵育15分钟
。与上一个步骤一样
，除去EDTA溶液并用HBSS（可选步骤）代替，并剧烈摇动管子约20 s。在显微镜下取出一个20μl上清液等分试样 ，以检查其是否包含所需的隐窝部分 。根据产量
，重复这些步骤，直到地下中清液中的隐窝富集为止
。 　　将新隔离的隐窝嵌入50μl未稀释的Matrigel（356231 ，cultek）中
，并在DMEM/F-12（D8437，Sigma-Aldrich）中培养 ，并补充了Penicillin-Stroptoptycin
，1×（2 mm）Glutamax（3505003500003，gibco ，glutamax），glutamax（2 mm）glutagycin
，glutagycin，glutagycin ，glutagycin cocco或life fernocial
，glutamax cocco，glutamax cocco copoHepes（15630049 ，Gibco或Life Technologies
，Thermo Fisher Scientific），2 mM N-乙酰半半胱氨酸（A8199-10G ，Sigma-Aldrich）
，1×B27补充剂（17504-044，Life Technologies） ，10 mm Nicotinamide（10 mm Nicotinamide）重组MEGF（PMG8044
，GIBCO），100 ng ML-1重组Noggin（250-38 ，Peprotech），1μgml-1小鼠R-Spondin 1（120-38
，Peprotech）和1％Normocin（Ant-NR-1，Invivogen）64。在最初的12小时培养物构建过程中 ，包括1.5μMCHIR99021（GSK3抑制剂
，2520691; peprotech）和10μMY-27632抑制剂（1293823，peprotech） ，然后更换培养基 。媒介每隔一天更改
。 　　如先前所述29进行了器官分化测定。简而言之
，将隐窝或单个细胞夹在矩阵中，并在24孔板的井中铺板 。基质凝胶聚合后 ，加入了500μl完整的晚期DMEM/F-12
。富集媒体如下。ISC富集培养基（ENR-CV）：EGF（50 ng ml-1
，生命技术），Noggin（100 ng ml-1 ，peprotech）
，R-Spondin 1（500 ng ml-1，R＆D）和包括CHIR99021（3μm ，demgent）和Valproic Aider（1MMMMMA），包括CHIR99021（3μm
，茎） 。Paneth细胞富集培养基（ENR-CD）：EGF（50 ng mL-1，生命技术） ，Noggin（100 ng ml-1
，peprotech），R-Spondin 1（500 ng ml-1 ，r＆d）和包括CHIR99021（3μm
，茎，茎）和dapt（10 µ-al）和dapt（10 µmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmms杯状细胞富集培养基（ENR-VD）：EGF（50 ng ml-1 ，生命技术）
，Noggin（100 ng ml-1，peprotech） ，R-Spondin 1（500 ng ml-1
，r＆＆＆＆＆＆＆＆＆＆d）和包括瓣膜酸（1 mM，sigma-aldrich）和10 sma-sma-sma-ddrhich（1 mm ，sigma-alich sma sma sma sma sma sma sma sma sma sma compons）。肠细胞富集培养基（ENR-IV）：EGF（50 ng ml-1，生命技术）
，Noggin（100 ng ml-1，peprotech） ，R-Spondin 1（500 ng ml-1
，r＆d）和包括丙丙酸在内的小分子（1 mM，sigma-aldrich）和iewprich（1 mm ，sigma-aldrich）和iewmp2（1 mM为了富含祖细胞
，类器官在ENR-CV中保持六天，然后将三天转移到相应的分化培养基中
。对于完全成熟的谱系 ，将富含ISC的类器官保持在分化培养基中至少六天。 　　如前所述
，分离出刚肠道的器官 。在电穿孔前四天，将它们保持在带有CHIR99021（10μm）的ENR培养基中
。每六孔板将五滴Matrigel（30–40μl）板条 ，并在电穿孔前一天刷新培养基。在电穿孔当天
，使用细胞恢复溶液（Corning，76332-050）从Matrigel中回收器官 ，并在4°C下以135g旋转5分钟 。然后将类器官重悬于每个孔中的200μLTryple（Life Technologies，12604021）中
，并在37°C的水浴中孵育3分钟
。随后，添加了5 mL PBS ，并将器官进一步机械解离。为了进行核能
，我们使用了2-3μg所需的质粒 。具体而言，在OGDH启动子中携带HNF4结合位点的记者构造 ，突变或野生型
。P3原代细胞4D-核型X试剂盒（Lonza
，V4XP-3024）用于核能。按照制造商的说明，在手术前立即准备了核反射缓冲液 。将器官重悬于20μL核反登核缓冲液中 ，并立即使用4D-核代理（LONZA）中的ESC程序进行电穿孔
。电穿孔后
，将100μLENR培养基带有CHIR99021和Y-27632抑制剂。将核定的类器官转移到Eppendorf管中，以1,200 rpm向下旋转5分钟 ，然后重悬于Matrigel中 。在实验之前
，允许类器官恢复过夜。 　　如上所述分离有机体，并在补充CHIR99021（10μM）的ENR培养基中保持四到六天
。接下来 ，双HNF4A和HNF4G shRNA及其各自的对照通过脊柱转导，如先前所述64。脊柱旋转后
，类器官以1,200 rpm旋转5分钟，并重悬于Matrigel中 。然后 ，允许类型器可以在选择或分类前恢复
。 　　对于使用类器官的实验
，采用以下治疗方法：2μgml-1（Sigma-Aldrich，D9891-25G）以3.35 mm的DM-αkg为3.35 mm（1：2,000稀释）（库存1：2,000）（Sigma-Aldrich ，Sigma-Aldrich
，102418940），octyl-αkg ，s 10mmmmma-in cy-syl-αkg876150-14-0）
，以10 mm最终浓度（Sigma-Aldrich，1391194-64-1）和DM核酸盐的最终浓度为3 mm（Sigma-Aldrich ，W239607）。 　　通过用EDTA机械破坏分离隐窝
，然后将它们嵌入基质中，从而进行肠道器官培养 。为了确保细胞数量一致 ，将来自五只独立小鼠的隐窝聚集在一起，并将所得的池嵌入基质中
。在每六孔板中将五个矩阵滴（每滴30-40 µL）铺板。将三份样品从合并的隐窝中铺上
，以保持实验中的一致性，因为LC -MS对细胞数的变化高度敏感 ，并且在板块板上与不同小鼠相同数量的类器官构成了具有挑战性 。如上所述
，器官保存在相关培养基中
。同样，作为Matrigel中存在的代谢产物的内部控制 ，在LC -MS实验中
，我们从Matrigel（相同数量的滴）中分离了没有器官的代谢物，但可以通过相同的培养方案。对于同位素图 ，将类器官转移到含有13c6葡萄糖或13c5谷氨酰胺的ENR-X培养基中
，无谷氨酰胺，并在采集样品之前孵育24小时 。 　　将上清液从具有或没有类器官的基质培养物中吸出
。将细胞裂解 ，并通过将1 ml冰冷的80％甲醇直接在基质液滴中添加到代谢物
，然后在-80°C下孵育过夜以帮助蛋白质沉淀。第二天，将甲醇提取物在4°C下以20,000克离心20分钟 ，并将800 µL上清液转移到新的管中，并在真空浓缩器（Genevac）中蒸发 。 　　对于使用LC-MS的代谢组分析
，将干提取物重悬于80 µL的40％乙腈中，在水中 + 20 µL的100％甲醇的水中液相色谱（Hilic）或在水中进行100 µL 50％甲醇的水 ，用于离子PAIR LCAIR LCATICATION。将样品涡旋并在冰上孵育20分钟
，每5分钟进行一次涡流，以确保足够的重悬
。所有样品在4°C下进行了一个最终离心（20,000g 20分钟） ，以去除任何残留的颗粒物。 　　在正电离模式下
，在6545 Q-TOF质谱仪（安捷伦技术）上进行了Hilic LC-MS分析 。LC分离是在使用溶剂A（10:90乙腈中的10毫米乙酸乙酸铵的梯度）上在获得性UPLC Beh amiDe色谱柱上（150 mm×2.1 mm，粒径1.7μm ，水域）进行的：含0.2％乙酸
，pH 4）和溶剂B（10毫米含量的含量0.2％actrim actrim actec：10％actrim actecic：actecient：acteci
。酸，pH 4）。梯度为0分钟 ，95％B；9分钟
，70％b;13分钟，30％b；14分钟 ，30％b；14.5分钟，95％b;15分钟
，95％b;和20分钟，95％B 。其他LC参数如下：流速为400μlmin -1 ，柱温度40°C和注射体积5μl
。其他MS参数如下：气体温度300°C
，气流10 L min -1，雾化器压力为35 psi ，鞘温度350°C
，鞘气流12 L min -1，VCAP 4,000 V和Fragmentor 125V。 　　在负电离模式下 ，在6230 TOF质谱仪（Agilent Technologies）上进行了离子对LC-MS分析 。LC separation was done on an XSelect HSS T3 column (150 mm × 2.1 mm, particle size 3.5 μm, Waters) using a gradient of solvent A (5 mM octylamine in water with 5 mM acetic acid) and solvent B (5 mM octylamine in methanol with 5 mM acetic acid), and post-column solvent with 90:10 acetone: DMSO.梯度为0.3 ml min -1：0分钟
，1％B；3.5分钟，1％b;4分钟 ，35％b;15分钟
，35％b;20分钟，100％b;在0.4 ml min -1：20.1分钟 ，100％b；和22分钟，100％B
，22.1分钟，1％B；和27分钟 ，1％B
。其他LC参数如下：库后流速0.3 ml min-1
，柱温度40°C和注射体积5μl。其他MS参数如下：气体温度250°C，气流9 L min -1 ，雾化器压力为35 psi
，鞘温度250°C，鞘气流12 L min -1 ，VCAP 3,500 V和Fragmentor 125V 。 　　使用Skyline和Masshunter Profinder软件v.10.0（Agilent Technologies）进行有针对性的数据分析
。使用Metaboanalyst（https://www.metaboanalyst.ca/metaboanalyst/moduleview.xhtml）进行了进一步的分析。 　　用冰冷的40:40:20乙腈：甲醇：含有5μML-L- L-或D-2-羟基氯丁胺酸-D3二氧化钠钠盐（多伦多研究化学品
，H942578）的水提取代谢产物 。在-80°C下过夜孵育后，在4°C下以20,000g的速度收集 ，超声处理和离心20分钟以沉淀蛋白质。Extracts were then dried in an evaporator (Genevac EZ-2 Elite. For LC–MS analysis, dried samples were derivatized with 100 μl freshly prepared 50 mg ml−1 (+)-diacetyl--tartaric anhydride (DATAN; Sigma) in dichloromethane acetic acid (v/v = 4:1) at 75 °C for 30 min. After cooling to room temperature, derivatized在氮气下在氮气下干燥样品
，并在LC – MS/MS分析之前重悬于100μL超纯水（18.2MΩ，purelab）中
。具有敏捷的1260个无穷二进制泵 ，并在水中施加流动阶段A的梯度（125 mg L-1的水甲酸甲酸甲酸甲酸盐，用甲酸3.5调节）和流动相B（100％甲醇）（100％甲醇）以300μl的梯度为300μlmin-1 equient the Analytical the Analytical the Analytical the Equient the AnemeT 0-5分钟。retention-time stability. Other LC parameters were as follows: flow rate 300 μl min−1, column temperature 40 °C, sample storage temperature 4 °C and injection volume 10 μl. MS source parameters were as follows: spray voltage 2,500 V, capillary temperature 300 °C, vaporizer temperature 250 °C, sheath gas pressure 50 psi and auxiliary gas pressure 40 psi. Compound-specific S-lens值如下：37 V（2HG）和41 V（氘代2HG） 。 （CE：13 V）
，132.9（CE：22 V）
。代谢物对映异构体的身份是通过与衍生化纯标准的保留时间进行比较来确定的。采集色谱图并使用TraceFinder软件（Thermo Fisher Scientific）处理 。 　　如上所述提取隐窝
。将新鲜分离的隐窝重悬于1.5 mL的基质中，并保持在冰上 ，以防止在镀层过程中组合聚合。首先通过测试1μL
，2μL或3μL的手机体基质，然后将带有器官的基质素进行优化 ，然后将2 µL铺板 。将样品铺在96孔海马板的中心
，位于三个点之间
。为了确保对照孔中的一致条件，将相同体积的基质核板铺板。为了说明每个孔中相同数量的类器官的铺板的变化 ，每条条件的整列被铺设为八个重复 。将适当的类器官培养基添加到每个孔中
，并将板保存在孵化器中，直到实验当天
。通常 ，在进行实验之前
，允许类器官适应两天。 　　如前所述进行测定65,66 。简而言之，在实验前一天 ，我们准备了完整的海马培养基：不含苯酚红的安捷伦海马XF（pH 7.4），并补充了葡萄糖（10 mm）
，丙酮酸（1 mm）和谷氨酰胺（2 mm）。所有试剂均调整为7.4的pH值
。将传感器板在37°C的水中激活过夜。在实验当天，通过除去类器官完整的培养基并使用完整的海马培养基清洗两次 ，从而制备了类器官 。将完整的海马培养基添加到类器官中
，并在非CO2孵化器中允许在37°C下适应30分钟（最大1小时）
。 　　对于有丝分子的测定（103015-100）和底物氧化测定，将以下浓度注入端口：寡霉素（端口A）以50μm ，20μm的FCCP
，Rotenone和Rotenone和antenonone and antimycin a，每个20μm。XF分析仪进行测定的设置如下：混合时间为4分钟 ，等待时间为0分钟
，测量时间为3分钟；混合时间为4分钟，等待时间为0分钟 ，测量时间为3分钟；FCCP（三个周期）
，混合时间为4分钟，等待时间为0分钟 ，测量时间为3分钟；以及紫红酮和抗霉素A（三个循环），混合时间为4分钟
，等待时间为0分钟，测量时间为3分钟 。对于长链脂肪酸氧化应激试验（103672-100） ，我们以浓度为20μm的Etomoxir补充了500μm的肉碱；对于葡萄糖/丙酮酸氧化应激试验（103673-100）
，我们在4 µm处使用了UK5099抑制剂；对于谷氨酰胺氧化应激试验（103674-100），我们在3 µm下使用了CB839抑制剂
。 　　在测定后 ，从所有井中拍摄了4倍明亮的图片
，以检查器官定位。为了进行归一化，我们计算了位于三个点之间的每个孔的类器官数量 。我们发现 ，这种归一化对于具有相似的器官大小和活力的条件效果很好
。对于底物氧化测定
，用不同抑制剂处理来自同一谱系的类器官样品，取而代之的是通过OCR百分比进行标准化样品以纠正每个孔中​​的器官数的差异 ，这是Agilent软件直接提供的（https://seahorseanalytics.agilent.agilent.com）。 　　如上所述分离了隐窝 。旋转后
，将隐窝在DMEM/F-12培养基（D8437，Sigma-Aldrich）中孵育 ，并补充了0.8 U ML-1外观（17105041，Life Technologies
，Thermo Fisher Scientific）和1 mg ML-1 DNase（04716728001，ROCHE）
。将细胞在37°C的2 mL“消化溶液”中孵育10-15分钟 ，每2分钟将样品涡流30 s。10分钟后
，取一个20 µL样品并在显微镜下观察以检查单细胞解离 。通过添加10毫升胎牛血清来停止消化。然后将细胞通过70μm的网格过滤，以290克向下旋转5分钟 ，然后重悬于MACS缓冲液中（0.5％BSA和2 mM EDTA
，在Ca2+/mg2+-fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Fre-Free PBS中）
。GFPHIGH（ISCS），GFPLOW（TA细胞） ，GFP-高侧散射和前向散射（Paneth细胞）和绒毛分数（机械细胞提取过程中的第一个分数）是从LGR5-EGFP-IRES-CREERT2小鼠中分离出来的
，并使用Sony Ma900 Celler分类。 　　为了对对照和DSS治疗的小鼠的固有椎板和肌肉层进行免疫表型，如先前报道的67 。简而言之 ，剖析了整个结肠
，纵向打开并以1×HBSS洗涤（Gibco，14025-092）
。将结肠切成0.5-1 cm的碎片 ，并使用8 mM EDTA机械解离。将其余的结肠碎片转移到使用分散酶和DNase的消化混合物中 。通过离心进一步沉积免疫细胞，如下所述
，进行了免疫表型分析
。 　　为了进行多参数流程仪分析，用活/死的可活力染料（1：500 ，Invitrogen
，r37601）在4°C的PBS中染色30分钟。此后，将细胞洗涤 ，用FC块（1：200
，BD Biosciences，564219）在FACS缓冲液中在4°C下孵育15分钟 ，然后用共轭抗体的鸡尾酒（请参见下文）在冰上进行30分钟 。染色后
，用FACS缓冲液洗涤细胞3次，并使用BD Cytofix/Cytoperm（Thermo Fisher Scientific ，544772）在4°C固定20分钟
，再次洗涤并存储以进行分析
。在带有五个激光器的BD LSR Fortessa中分析样品，并通过荧光微米对照设置门。 　　以下抗体用于流动性分析：AF700 CD45（Biolegend ，103128，克隆30-F11
，1：200），BUV395 CD11B（BD Biosciences ，563553
，563553，Clone M1/70 ，1：200）
，1：200），PE F4/80（Biolegend ，Biolegend
，1233110，Clone BMM）（BD Bioscience ，563005
，克隆1A8，1：200） ，APC CY7 LY6C（Biolegend，128026
，克隆HK1.4，1; 200） ，APC MHCII（Biolegend
，107614，107614 ，Clone M5/114.15.2
，1：200），Bv710 CD206（141）（141）C068C2 ，1：200）和BV650 CD86（Biolegend
，105035，克隆GL-1） 。 　　根据制造商的说明（ABCAM ，AB199083）
，使用ELISA纵向收集粪便样品，并使用ELISA分析LCN2水平
。在含有0.1％Tween 20的PBS中重构冷冻的粪便样品 ，浓度为100 mg ml -1。将样品涡流20分钟以实现均匀悬浮液，然后在4°C下以12,000 rpm离心10分钟 。收集清晰的上清液并将其存储在-20°C下直至分析。将测量值标准化为粪便样品的重量
。 　　嵌入石蜡之前
，将小鼠组织在4°C的福尔马林中固定过夜。将五微米的切片脱蜡并用组织清除（Thermo Fisher Scientific，National Diagnostics）和酒精系列重新水化 ，并通过在柠檬酸盐抗原检索缓冲液（Vector）中煮沸而进行抗原检索 。在5％BSA的PBS中阻塞载玻片
，并在4°C下封闭缓冲液 + 0.02％Triton X-100时进行一级抗体染色
。使用了以下主要抗体：鸡抗GFP（1：500，ABCAM 13970） ，鼠标抗KI67（1：500
，BD，550609） ，兔抗P53（1：500
，NCL-L-P53-CM5P，Leica Biosystems ，Leica Biosyste）
，Rabbit Anti-5HMC（1：1：5HMC）抗β-catenin（1：200，BD ，610153），兔抗OGDH（1：100
，ProteIntech，15212-1-AP） ，兔抗VDAC（1：100
，ABCAM，ABCAM ，AB15895）
，山羊抗ACE2，Anti-Anti-Anti-act Anti-Anti-Antio ant-Antio Fisher Scientific ，Pa5-4774888888888）Fisher Scientific, MA5-32154), rabbit anti-BrdU (1:100, Abcam, ab6326), rabbit anti-cleaved caspase 3 (1:200, Cell Signaling, 9664S), mouse anti-HNF4α (1:100, Thermo Fisher Scientific, MA1-199), mouse anti-TET1 (1:100, Thermo Fisher Scientific,MA5-16312), rabbit anti-TET2 (1:100, Thermo Fisher Scientific, PA5-85488), rabbit anti-TET3, (1:100, Thermo Fisher Scientific, PA5-31860), rat anti-CD8 (1:200, 14-0808-82, Thermo Fisher Scientific) and rat anti-CD4 (1:100, Thermo Fisher Scientific,14-9766-82）。用以下荧光结合的二抗检测到主要抗体：山羊抗chicken AF488（Life Technologies A-101039
，1：1,000），山羊抗兔AF488（Life a-322723 ，1：1,000）
，goat Anti Anti Anti-Rabbit Af594（goat afi-Rabbit af594）AF488（Life Technologies，A-32723 ，1：1,000），山羊抗小鼠AF594（Life Technologies
，A-111032，1：1,000） ，山羊抗鼠AF488（Life Technologies
，A-111006，1：1,000）和山羊抗Rat Anti-Rat 594（Life-Rat 594） 。在阻止缓冲液 + 0.02％Triton X-100时稀释所有二级抗体 ，并在室温下孵育一小时
。然后将载玻片用PBS洗涤
，并用含有DAPI的PB的核对核染色，并用延长的黄金（生命技术）安装在盖玻片下。 　　人类研究中使用的样品是从Tissuearray（https://www.tissuearray.com/）获得的 。具体而言 ，使用组织微阵列（TMA）CO809B
，CO246，CO245A
。如上所述 ，使用相同的初级和二级抗体进行免疫荧光染色。 　　使用细胞回收溶液（354253
，康宁BD）回收器官，并在室温（18-21°C）下用4％多聚甲醛（PFA）固定20分钟 。接下来 ，样品通过乙醇系列（70％，96％和100％）
，并嵌入石蜡中
。使用上述标准技术，使用相同的初级和二级抗体 ，使用标准技术进行免疫组织化学和免疫荧光。 　　使用Axiovision软件使用Zeiss AxioImager显微镜获取图像 。每张幻灯片获得五到十幅图像。通过计算每个隐窝或绒毛的阳性细胞数量（量化至少50个隐窝和100个绒毛）
，或使用ImageJ v.1.7软件中的颜色反vlution插入插件来计算正面积的百分比
。作者开发了其他宏来量化免疫荧光图像。 　　使用用于小鼠组织的彗星Lunaphore Platform68和福尔马林固定石蜡包裹（FFPE）组织的人TMA进行多重免疫荧光成像 。如上所述（“免疫荧光
”部分）进行了组织加工，其关键区别是抗原检索包括使用两个缓冲液
。具体而言 ，在去脱蜡后
，将载玻片在柠檬酸酯抗原检索缓冲液（pH 6.0，矢量实验室H-3300-250）中煮沸 ，然后直接转移到Tris-EDTA透明溶液中（pH 9.0
，载体实验室H-3301-250），然后再次煮沸。这种双重抗原检索方法改善了我们的样品中的抗原卸载 ，从而使能够与柠檬酸盐或EDTA缓冲液一起使用的抗体组合 。抗原检索后
，将载玻片加载到相应的平台上
。有关抗体面板和染色条件的详细信息，请参见补充表4（彗星Lunaphore小鼠面板）和5（CellDive Human Panel）。对于细胞多种免疫荧光 ，使用原代和二抗进行了第一轮染色 。在大多数情况下，随后的回合使用了主要的共轭抗体
。此外
，如前所述进行了剥离步骤，允许在同一TMA上进行第二轮初级和二级抗体染色。根据制造商的说明（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/a20186） ，将HNF4α抗体自缀合 。 　　如前所述进行了Smfish分析
，并在协议中进行了轻微的修改71
。 　　我们建立在已发布的软件72,73上，为Smfish设计自定义面板。这种设计策略依赖于在小鼠cDNA中发现的所有可能30-Mer序列（Ensembl grcm38.p6）的预先计算 ，并用在我们的小鼠模型中设计的荧光蛋白的编码序列增强 。我们从mRNA的潜在库中排除了假基因
，以设计探针。我们计算了每个30-MER的多个分数，包括TM ，GC含量以及与核糖体RNA（RRNA）和转移RNA（TRNA）杂交的潜力
。我们使用以下标准在我们的候选探针集中包括30-MER：GC含量为43-63％和TM（66-76°C）
，不包括30-mers，其中至少包含RRNA或TRNA中的15-Mer。此外 ，我们计算了表达信息的惩罚
，以估计每个候选探针的特异性 。我们调整了已发布的软件72,73，将单细胞信息包括在特异性分数的估计中
。我们认为 ，合并单细胞信息会减少在稀有细胞群体中选择探针与高表达基因的探针的机会。为此，我们使用了参考文献中图1中使用的已发布的单细胞数据 。26.以下建议的参数来自原始的Merfish Publications 72,73
，我们认为30-Mers的特异性得分大于0.75是我们面板的候选人
。我们旨在选择每个基因的92个非重叠探针。每当由于转录长度，与其他基因或其他序列特性同源的情况下 ，我们都允许探针之间的最大重叠为20 bp 。探针序列可以在补充表3中找到
。 　　将“瑞士”肠道放在盒式盒子中
，并在4°C下用4％PFA 1×PBS溶液固定四个小时。然后将磁带转移到1×PBS中的4％PFA和30％的蔗糖中，并在4°C下孵育过夜 。为了保存绒毛结构 ，将盒式盒转移了四个小时至30％的蔗糖和50％的蔗糖
，在室温下三个小时，最后嵌入了Tissue Plus Oct Compound（Fisher Healthcare ，4585）中的Cryomold（Tissue-Tek
，4557）
。将霉菌放在干冰上，直到将所有OCT冷冻 ，并将肠样品存储在-80°C下。 　　如前所述
，制备了用于弹性染色的盖板 。简而言之，通过将它们浸入室温下37％HCl和甲醇的1：1混合物中 ，清洁了40毫米直径的盖玻片（Bioptechs，0420-0323-2）。然后将盖玻片用Milli-Q水洗涤
，用70％乙醇洗涤一次，然后用氮气轻轻干燥
。清洁的盖玻片在0.1％（v/v）三乙胺（Millipore ，TX1200）和0.2％（v/v）烯丙基氯硅烷（Sigma
，1077778）中浸入氯仿，在室温下30分钟。它们用氯仿洗涤一次 ，并用100％乙醇洗涤
，然后使用氮气干燥 。在室温下，将盖玻片长期存储在干燥的腔室中
。 　　为了制备用于染色的单个样品的盖板 ，将预处理的盖玻片涂有0.1 mg ml-1聚赖氨酸（Thermo Fisher Scientific
，A3890401）在室温下持续一小时。接下来，用1×PBS洗涤一次 ，并用无核酸酶的水洗涤3次 。在那之后
，将它们干燥至少两个小时，然后再切除组织
。 　　将10μm厚度的组织切片安装到涂层的覆盖层中。将盖玻片在50°C下干燥5-10分钟 ，并将其放在干冰上，直到完成所有样品的切片 。接下来
，将带盖玻片的板转移到冰上，并用3毫升1×PBS处理 ，然后在室温下用4％PFA 1×PBS固定10分钟
。然后用1×PBS将盖玻片洗涤3次
，并在4°C下在冰冷的70％乙醇中维持过夜，以进行透化。 　　过夜孵化后 ，将盖玻片用1×PBS在冰上重新水化了10分钟 。为了将谱系记者的漂白内源性荧光和溶菌酶颗粒的自动荧光减少
，将组织与3％的过氧化氢（Thermo Fisher Scientific，H325-500） ，1：600 37％HCl（V/V）1×PBS孵育
，将其放置在一个小时的温度下
。然后将它们用1×PBS洗涤两次，然后用2×SSC洗涤一次。接下来 ，用含有20μgml-1蛋白酶K（Sigma
，3115836001）的终浓度的消化溶液（在37°C下预热）处理它们，并在2×SSC溶液中进行处理 ，并在37°C下孵育10分钟 。接下来，用2×SSC洗涤盖玻片
，并用杂交溶液（30％甲酰胺（Thermo Fisher Scientific，AM9344）和2×SSC处理 ，并在37°C下孵育三个小时。 　　在3H染色缓冲液（30％甲酰胺
，10％硫酸葡萄酸盐（Sigma-Aldrich，D8906-50G） ，1 mg Mg ml -1酵母tRNA（Thermo Fisher Scientific
，15401029）和2×SSC）中，将原发探针稀释至每个探针100 nm
。另外 ，将2μM锚探针添加到包含特定探针的染色溶液中。然后将100 µL的液滴在填充孵育后添加到盖玻片上
，然后将盖玻片放在15厘米的盘子上，用湿的Kimwipe用作湿度缓冲液 ，并在37°C下孵育36-48 h 。接下来
，将杂交后洗涤缓冲液（30％甲酰胺和2×SSC）预热至37°C
。用杂交后洗涤缓冲液在47°C下洗涤两次，持续30分钟。最后 ，将盖玻片转移到2×SSC溶液中，并保持在4°C
，直到下一步 。 　　将样品嵌入到聚丙烯酰胺凝胶的薄层中，以通过消化蛋白质和脂质进行随后的组织清除
。The gel solution was composed of 4% (v/v) 19:1 acrylamide/bis-acrylamide (Bio-Rad, 1610144), 60 mM TrisHCl pH 8 (Invitrogen, 15568-025) and 0.3 M NaCl (Boston BioProducts, R-244), supplemented with the polymerizing agents ammonium persulfate (Sigma, 09913)和Temed（Sigma ，T7024）的最终浓度分别为0.03％（w/v）和0.15％（v/v）
，并如前所述71。在室温下两个小时后，聚合完成 。接下来 ，将凝胶包裹的盖玻片转移到具有2×SSC的6厘米组织培养皿中
。用消化溶液在37°C的37°C下过夜
，用2％SD（Invitrogen，AM9822） ，0.25％Triton X-100（Acros Organics
，327371000）和A 1：100稀释蛋白酶K（NEB，P8107S）在2×SSC中。过夜消化后 ，将样品用2×SSC洗涤30分钟
，并轻轻搅动 。 　　我们使用了由荧光团（Alexa Fluor 488，CY3B ，CY5或Alexa Fluor 750）组合的20 bp寡核苷酸组成的读取探针
。荧光共轭探针购自生物合成。次级染色溶液由2×SSC中的5％碳酸乙二烯（Sigma-Aldrich，E26258-100G）组成 。次级染色溶液通过以3 nm的最终浓度为每种荧光颜色的次级读数探针补充
，最终浓度为1μm。遵循与主要染色步骤相同的步骤进行次要染色，但在室温下进行20分钟 ，覆盖了铝箔的样品
。杂交后
，将样品用10％碳酸盐在2×SSC中洗涤一次，搅拌20分钟 ，三次用2×SSC每次洗涤5分钟。 　　如前所述71进行迭代smfish成像 。补充表3中提供了读出序列和目标mRNA物种的组合
。 　　为了将Z堆栈崩溃到单个二维图像中
，使用Nikon Elements软件的最大投影函数生成了最大投影图像。每一轮鱼成像之后，我们拍摄了一个带有裂解的荧光团的额外图像 ，以捕获每个通道的背景信号 。由于显微镜对五个荧光团具有不等的敏感性
，因此我们还对每个荧光团的平坦场进行了成像以捕获其偏见
。我们通过减去每个基因的背景信号，然后除以共轭荧光团的平面偏置 ，然后将阈值分开以纠正任何负值的像素来纠正生鱼图像。使用DAPI进行额外的对准 。 　　如上所述
，收集了来自C57BL/6小鼠的十二指肠样品并制备
。将一到两毫米的肠道样品固定在2％戊二醛，4％PFA和2 mM CaCl2中 ，在0.1 M Cacododylate缓冲液中，在室温下
，pH 7.2，在室温超过一个小时 ，在一个以上脱水
，在丙酮系列中脱水，在1％Osmium osmium osmium osmium perdroxide sere demere and empered perded perded perded perded（均为epented）中 ，供应12（emented）。切割超薄切片（65 nm）
，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在Tecnai 12电子显微镜（FEI）中成像 ，在120 kV下运行
，并配备了AMT Biosprint29数码相机（AMT Imageing） 。如先前所述74进行线粒体定量
。 　　在含有强力霉素诱导的GFP耦合SHRNA30,33的小鼠ES细胞中进行免疫印迹。所使用的基因型是Shogdh_2081，Shogdh_346（参考文献1）和SHREN_731 。小鼠ES细胞用强力霉素处理72小时。简而言之 ，除去上清液
，并用PBS将细胞洗涤3次
。然后，使用RIPA裂解缓冲液（Sigma-Aldrich ，R0278）裂解小鼠ES细胞，并补充了NAF（1 mm）
，Na4p2O7（20 mm）（20 mm）和Na3VO4（2 mm）。将裂解物在冰上孵育15分钟，然后通过在4°C和10,000克离心进行澄清 。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（23225 ，Thermo Fisher Scientific）根据制造商的说明确定蛋白质浓度
。通过将适当量的蛋白质裂解物与2x Laemmli缓冲液煮沸（4％SDS
，20％甘油，10％2-巯基乙醇和0.004％Bromophenol蓝色 ，在90°C下
，裂解物浓度为1 mg ml-1 1（4％SDS，20％甘油 ，10％2-羟基乙醇和0.004％Bromophenol蓝色
，在90°C下为0.2 M Tros-Hcl，pH 7）。将20微克蛋白质裂解物加载到SDS-PAGE凝胶上 ，并转移至0.2μm硝酸纤维素膜（Li-Cor Biosciences
，926-31090） 。将膜用5％的印迹级阻滞剂（非脂肪干牛奶，170-6404 ，Bio-Rad）在Tris缓冲盐水中，含有1％Tween 20（TBS-T）
，持续一个小时
。然后将膜在4°C的TBS-T中与3％叠氮化钠与兔抗OGGDH抗体（1：500，ProteIntech ，15212-1-AP）一起孵育过夜。在室温下用TBS-T将膜用TBS-T进行了10分钟后
，将膜与次级抗兔抗体（1：5,000，细胞信号 ，7074s）一起孵育1％ 。根据制造商的说明
，使用增强的化学发光（ECL）检测试剂（细胞信号，68833）可视化蛋白质带
。 　　在室温下以1％的甲醛分离并在室温下分离肠道隐窝10分钟。通过将1.25 m甘氨酸添加到最终浓度为125 mm来停止交联反应 。然后将隐窝在4°C下离心10分钟 ，然后在冷PBS中洗涤
。将细胞用1 mL裂解缓冲液1（50 mM HEPES-KOH
，pH 7.5，140 mM NaCl ，1 mM EDTA
，10％甘油，0.5％NP-40 ，0.25％Triton X-100和1×蛋白酶抑制剂），然后在4°C下进行离心。将沉淀重悬于裂解缓冲液2（10 mM Tris-HCl
，pH 8.0，200 mm NaCl ，1 mM EDTA
，0.5 mM EGTA和1×蛋白酶抑制剂）中 。最后，将颗粒重悬于1 ml裂解缓冲液3（10 mM Tris-HCl ，pH 8.0、100 mM NaCl
，1 mM EDTA，0.5 mM N-洛洛酰sarcosine和1×蛋白酶抑制剂）和100μL10％Triton X-100。使用E220聚焦超声器（Covaris ，PN 500239）对样品进行超声检查10分钟
。在流动条件下（140 PIP
，5％占空比，200 cbp） ，使用AFA纤维（Covaris
，PN 520130）与AFA纤维（Covaris，PN 520130）进行超声处理样品。使用布拉德福德测定法对可溶性分数进行定量 ，并使用400μg的可溶性部分用于免疫沉淀HNF4α（1μg，Thermo Fisher Scientific
，MA1-199）和Smad4和Smad4（1μg，细胞信号 ，46535）
，用Rabbit Igg（1μg）（1μg）（1μg）（1μg，圣克鲁斯生物技术 ，SC-2025）用作对照 。将染色质和抗体混合物在4°C下孵育过夜
，总体积为500μl
。然后用Triton稀释缓冲液（1％Triton X-100
、2 mM EDTA pH 8、150 mM NaCl和20 mM Tris-HCl pH 8.1），混合胶束洗涤缓冲液 ，1％Triton X-100 、1％Triton X-100
、5 mm EDTA pH 8、150毫米Nac nac nac nac
，tris nAC，TriS h.10毫米20毫米 ，TriS-NAC ph 8.1％
，pH 8.1 ph 8，150毫米 ，Tris 5毫米，TriS ph 8.10毫米
，Tris-NAC，TriS 5％ ，Tris pH 8.1）依次洗涤免疫沉淀的混合物。0.2% NaN3 and 0.2% SDS), buffer 500 (0.1% w/v deoxycholic acid, 1 mM EDTA pH 8, 50 mM HEPES pH 7.5, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.2% NaN3) and a LiCl wash buffer (0.5% w/v deoxycholic acid, 1 mM EDTA pH 8, 250毫米LICL
，0.5％V/V NP-40 、10毫米Tris-HCl和0.2％NAN3） 。将样品除外，并使用苯酚 ，氯仿和异醇混合物提取DNA
，并用80％乙醇洗涤，并重悬于200μlTE缓冲液中
。使用特定引物进行QRT -PCR（补充表2）。 　　在进行任何统计测试之前 ，我们使用D'Agostino -Pearson检验测试了正态分布 。对于连续变量
，我们使用了t检验，Mann-Whitney U测试 ，单向方差分析或Friedman的测试
。对于分类变量
，我们使用了卡方测试或Fisher的精确测试。Mantel -Cox检验用于分析小鼠的Kaplan -Meier生存 。如果发现单向方差分析的显着差异，则使用Tukey的多重比较测试进行小组比较
。如果发现Friedman的测试有显着差异 ，则使用Dunn的多重比较测试。OGDH表达在肠球细胞，ISC和Paneth细胞中的预测值通过检查接收器操作特征（ROC）曲线下的面积
，置信区间为95％ 。当P小于0.05时，所有统计检验均认为具有统计学意义。图中的统计显着性总结如下：*p≤0.05 ，**p≤0.01
，***p≤0.001和****p≤0.0001之间至少三个样本的均值
。结果表示为平均值±S.E.M. 　　所示的免疫荧光，H＆E ，其他染色和IHC数据代表至少三只独立小鼠。在至少3只独立的小鼠中
，对免疫荧光，H＆E和其他染色进行定量 ，每只小鼠100个绒毛 。对于体外实验
，进行了至少三个独立的实验
。对于体内实验，每组使用至少五只小鼠。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。