亲和力优化增强子变体破坏了开发

　　次优亲和结合位点在各种增强子中都普遍存在，包括OTX-A ，SVB，ZRS，IFNβ增强体和许多与疾病相关的增强子和发育性心脏增强子和增强剂20,21,22,22,42。在这里，我们表明，单核苷酸的变化略有增加结合亲和力，导致小鼠和人肢中组织特异性和有机表型的丧失。在一项互补研究中，我们发现在ciona心脏增强子中的亲和力优化SNV驱动非心脏细胞中基因FOXF的异位表达，这会导致异常的细胞迁移和心脏缺陷，而心脏缺陷则严重，就像两次击败Heart42 。我们的结果表明，次优亲和位点的流行率在基因组中产生了脆弱性，从而使亲和力优化的SNV可以驱动异位GOF表达和表型。　　鉴于我们的发现，更加关注低亲和力，但高度退化的位点对于识别和预测休闲增强子变体至关重要。在这项研究中，我们表明PBM是测量亲和力的高效方法。尽管无疑是由其他体内因子调节的体内结合，例如蛋白质 - 蛋白质相互作用，IDR和其他分子相互作用，但我们的结果表明，转录因子结合的亲和力是驱动增强剂活性和基因表达的基本特征。这种简单的体外测量的使用提供了一种系统的方法来识别不依赖细胞类型中特定测量值的因果增强子变体。这是一种可概括的方法，用于确定适用于基因组，细胞类型甚至物种的因果GOF增强子变体。　　ETS-A位点是8 bp序列，该区域内有65,536个可能的序列组合。在这些组合中，我们根据结合亲和力的变化，成功地预测了五个不同的ETS-A序列（法语2，Indian 2 ，Syn 0.25，syn 0.25，ETS-A LOF和SYN 0.52）的表达和表型。这些实验证明了机械规则预测因果增强子变体的力量。将来，我们将不仅要识别因果增强子的变体来预测严重性和外观。在ZRS ETS-A站点内，亲和力的增加会导致更严重和渗透性表型。对于在同一绑定位点和增强子中同一位置处发生的所有亲和力的变化，这可能是正确的，因为所有这些亲和力都会增加在相同的上下文或语法中。亲和力优化SNV的影响可能会受到周围结合位点的调节，以便尽管增强子中不同位置的变体具有不同的效果，尽管相同的亲和力增加了43。我们在Ciona Foxf Heart Enhancer中对亲和力优化SNV的研究中看到了这一点。整合对亲和力优化的SNV和增强剂语法的理解将完善我们预测增强子变体的严重性和渗透率的能力。　　我们发现会导致GOF（但不是LOF）的增强剂变体破坏了发展。增强剂在多个层面上的冗余可确保生物体内的鲁棒性。通常，多个称为冗余或阴影增强剂的增强剂调节相同的基因44,45。另一层增强子冗余在增强剂46,47中编码，这是ZRS15中的五个ETS位点（ETS1 – ETS5）的例证。因此，单个激活器位点的丢失，激活剂位点的亲和力的降低甚至整个增强子的损失都可以通过冗余站点或增强子来补偿。相比之下，导致表达水平增加或时空异位表达的GOF变体更难缓冲，因此更可能影响基因表达和发育。LOF ETS-A位点示例，该位点没有影响，而所有四个GOF变体都驱动异位基因表达并破坏肢体发育。关注导致GOF表达的变体可以提高我们查明因果增强子变体的能力。　　转录因子的簇通常与主动增强子接近。这些已被描述为枢纽，并且包含大量转录因子，这些转录因子可能是相位的48,49 。在这样的环境中，单基本对变化可以对表达产生如此明显的影响是违反直觉的。在生化水平上，我们推测，亲和力的细微增加使激活剂的停留时间更长。这可能会增加所有必需因素结合的机会以及可以触发转录的功能复合物的形成。进一步研究了一种稍微增加结合亲和力的SNV可以将转录激活定核的机制可以帮助我们了解转录控制背后的驱动力。　　ZR中的31个人SNV与多态度相关。其中只有七个位于经过验证的绑定位点。这可能是结合位点的退化性质以及我们对ZRS功能结合位点的不良注释的结果。在结合位点的七个SNV中，三个是亲和力优化的SNV。这些SNV中的两个位于ETS-A网站（法语2和印度2）中，一个在HOX站点（荷兰2）中。ETS-A亲和优化SNV在前肢芽中引起异位GOF表达。茎四脚架是多态度的，用七个或八位数字50。阻遏物在前肢芽中的表达可能导致了衍生的五位数状态。我们推测ETS-A亲和优化SNV在前肢芽中引起异位表达，因为亲和力的增加会破坏作用于前肢芽中增强剂的激活因子和阻遏物的平衡，并且由于进化敏感性。　　与表型和疾病显着相关的数百万变体位于增强剂1,2,3，在功能上测试所有这些是一个主要挑战。MPRA式实验测定通过记者测定法测定增强子变体的效果；但是，此类测定法具有局限性，因为它们没有在内源性基因座或适当的细胞或多细胞上下文中测试变体30,40。此外，MPRA倾向于强调导致表达最大，最重要的变化的变体。但是，这些可能对表型没有最大的影响。实际上，法式2和印度2变体仅在短时间内驱动异位表达，但这足以形成额外的数字。尽管并非所有小型的异位表达的动态结构域都会引起表型，但形态剂的时间和空间表达，信号轨迹蛋白和效应子的时间和空间表达的小变化，尤其是在这些细胞类型的情况下会改变身份 - 可能导致模式缺陷和表型。根据靶基因的类型和细胞环境的灵敏度，权衡表达变化程度，并通过关注引起GOF而不是LOF表达的变体，可以提高我们预测改变表型的增强子变体的能力。　　增强子通常根据几种特征进行分类：它们与启动子的相互作用方式；它们的序列保守水平；他们与目标启动子的距离；他们的靶基因；它们活跃的组织；以及发现它们的物种。我们对ZRS，FOXF心脏增强剂，IFNβ的研究增强了肌体和疾病相关增强剂，以及我们的EQTL分析，表明，使用次优亲和位点编码增强子特异性，以及在GOF基因表达中的亲和力 - 优化SNV的作用，转化为这些类别。更广泛地说，跨不同增强剂的监管原则的保护为使用违反此类规则的行为预测增强性疾病的因果变体提供了一个框架。

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