DNA折纸旋转棘轮电机

　　我们使用DNA折纸29,30的方法设计和制造了40 nm和30 nm宽的基座 ，我们在该基座上固定了一个等边三角形平台
，边缘为60 nm，厚度为60 nm ，厚度为13 nm（图1A – C和补充图1和2） 。通过三角形平台的中央腔突出的基座的一部分包括一个转子臂的对接位点
。对接位点是通过一个枢轴点固定的
，该枢轴点由基座上三角形平台的中点附近的三个未配对的核苷酸组成。转子臂依次由两个端到端连接的刚性杆模块（每个都是单独的DNA折纸）组成（图1D，E和补充图3） ，总长度为550 nm 。选择转子臂的长度以在衍射限制的荧光显微镜中实时跟踪各个电动机的角度变化
，并通过溶剂易于启发，通过粘性摩擦来减慢角运动 ，并受Kinosita的经典实验的启发，以及其他型号的经典实验
，这些实验显示了单个f-Actactin-actactin-labell labell labelled f1-apase f1-atpase的旋转
。杆模块由以蜂窝晶格图案排列的十个DNA双螺旋组成（图1D，E）。以前 ，此类螺旋束在几微米制度中具有持久性长度31 。因此
，转子臂可以被视为刚性但弹性杆
。转子臂在枢轴点的两侧突出，超出了三角形平台的范围。通过这种设计 ，转子臂在三角形平面内的枢轴点围绕枢轴点的单轴旋转受到约束 。我们还在三角形平台的三个边缘上安装了物理障碍（图1C）。障碍物由长18 nm的矩形板组成
，它们从三角形平台的表面伸出约50°
。将板以这个角度用一组双螺旋垫片牢固地固定。为了克服在三角形平台上扫地时的障碍，转子臂必须向上弯曲 。弯曲构成了一个充满活力的障碍 ，可以以玻璃体加权方式将转子捕获在障碍物之间
。该电动机还包括功能修饰
，例如生物素部分和荧光染料（图1F），以实现对单个运动颗粒运动的实验观察。使用生物素部分 ，可以通过几个生物素 - 含甲二丁素键将其严格连接到显微镜玻璃盖玻片上
，并且每个定子的多个荧光染料在旋转臂的尖端上允许使用Centroid Tracking 32相对于单独标记的三角形三角形平台的位置来确定其方向 。 　　在热平衡中，任何方向上的任何运动都将通过相反的运动来抵消 ，以使系统不会在长期以来的限制下偏向
。否则，我们将拥有一个永久手机。因此
，我们的电动机被设计为在不平衡条件下作为棘轮操作 。为了引起不对称或有偏见的棘轮效应，我们使用浸入液体室内的电极应用了非旋转电流（AC）场（AC）磁场（图1F ，另见扩展数据图1）
。该场导致交替的离子电流沿固定轴流过样品室。该外部调制产生的时间平均净力为零 。外部调制没有提供的信息可以决定电动机的旋转
。取而代之的是
，根据电动机相对于电场轴的电动机中能量最小值的性质和位置，调制可以每一个场循环产生动力学不对称性 ，从而导致电动机以优选的旋转方向移动（扩展数据图2）。 　　我们在DNA序列29（补充数据集1-5）中编码了运动设计
，并使用先前描述的程序在一锅反应混合物中自组装了电动机33 。我们使用凝胶电动迁移率分析（扩展数据）评估了自组装的质量（图3），并验证了运动复合物的3D形状 ，包括基座
，三角形平台和转子码头，并使用3D电子密度图 ，我们使用单个粒子冷冻微镜显微镜（Cryo-em）确定了3D电子密度图。在分辨率中
，电子密度图显示了所有所需的主要结构特征，包括障碍物和转子码头
。我们还通过具有负染色的透射电子显微镜（TEM）成像成像的全长转子臂的完整电动机配合物的正确组装（图2C）。 　　在平衡中表面毫米变形的电动机颗粒的总内反射荧光（TIRF）显微镜显示旋转颗粒 ，其中转子臂优先驻留在六个离散位置（图2D和扩展数据图5A和6） 。这些位置对应于方向，转子臂被困在突出的障碍物的两侧
，我们使用DNA-Paint Imaging34建立了该方向（图2E和扩展数据图5B）
。DNA绘制图像还提供了三角形平台与更长的转子臂的相对尺寸的引人入胜的说明。因此，我们的电动机配合物实现了一种扩散的旋转机制 ，具有多个能量的最小值（扩展数据图7） 。 　　我们使用Centroid Tracking32从单粒子TIRF视频中更准确地确定每个框架的转子臂方向
。在平衡中
，即，当外场关闭时 ，运动颗粒显示出无偏的随机旋转运动
，其累积角位移消失了，这是能量景观中平衡波动所预期的（图3A和扩展数据图8）。相比之下 ，当我们打开AC场时
，一部分电动机颗粒（32.3％）立即从随机的，无向的旋转变为具有方向性偏差的过程旋转（图3A和补充视频1和2） 。我们记录的最大角速度约为每分钟250个完整的回合 ，并且在磁场打开时
，在顺时针（CW）和逆时针（CCW）方向上进行过程旋转的电动机大约相等（图3B）
。 　　旋转方向和每个电动机粒子的有效角速度可以通过AC场轴相对于电动机颗粒的方向（固定在基板上）来控制。为了证明这一特性，我们使用了一个四电极设置 ，该设置使我们通过在玻璃盖平面的X和Y方向上施加的电场的叠加来调整AC场轴的有效方向 。在一组实验中，我们每1.6 s以5°的速度旋转AC场轴
，同时记录和跟踪单个运动动作
。结果，我们获得了单个粒子轨迹 ，这些轨迹可作为时间的函数
，每个粒子的累积角位移（图3C和补充视频3和4）。从这些数据中，我们计算了每个电动机的有效角速度 ，并将其绘制为场轴在每个1.6 s增量中具有的方向的函数（扩展数据图9） 。对于大多数电动机
，我们观察到运动速度对场方向的正弦依赖性，包括停滞和方向逆转。每个电动机都有特定的交流场取向 ，该电动机的电动机显示最大和最小速度
。我们将这些“相移 ”归因于电动机速度之间的这些“相移
”
，即在显微镜盖玻片上以随机方向固定电动机。我们将角速度与场取向数据保持一致，并计算了75个电动机颗粒合奏的角速度的平均值和标准偏差 ，从而给人以运动对运动速度变化的印象（图3D） 。我们还表征了单个电动机的动力学作为交流场频率和振幅的函数（图3E – G和补充视频5-8）
。电动机的有效角速度取决于交流频率
，最佳的驱动频率为最佳。应用DC场时不存在旋转的定向偏置，并且在高AC频率（100 Hz）下也消失了 。相似地 ， 电动机的角速度也可以通过交流场振幅控制，显示20至60 V之间的振幅带中的最佳有效角速度
。 　　根据记录的数据
，我们可以估计电动机在环境上完成的扭矩和工作，在我们的图3实验中 ，这是以溶剂溶剂的摩擦拖动形式消散的。转子臂的旋转摩擦系数约为4×10-22 n m s 。根据25个弧度s-1（1,500°s-1）的最大观测角速度
，我们达到的最大扭矩约为10 pn nm，可以与F1F0-ATPase可以产生的50 pn NM进行比较
。在摩擦中消散的电动机的估计最大功率为250 pn nm s -1（62 kbt s -1） ，这对应于在细胞条件下每秒大约2.5 ATP分子的水解提供的自由能的当量。 　　我们可以通过考虑图4A – C中的有效能量景观来深入了解电动机的机制
，该景观是针对简化的两米型旋转电动机的不同定子场方向进行了示例计算的（另请参见扩展数据图2） 。净方向性选择所需的不对称性（偏置或棘轮）是由电动机提供的背景静态电势景观与外部调节场之间的相互作用产生的
。不对称的程度取决于在这些能量景观中通过Langevin Dynamics模拟示例性的运动能量景观相对于场相对于场的方向（图4C），分别导致CW ，CCW和方向性偏置的不存在。由于我们在实验中将电动机颗粒随机沉积在显微镜覆盖载玻片上
，因此我们获得了相对于磁场轴的电动取向的大约均匀采样，因此以各种速度旋转CW或CCW的电动机采样（图3C ，D） 。补充视频9–11示意性地总结了预期运动速度如何取决于场取向
，频率和振幅。 　　为了在单个电动机级别测试我们机制的不可逆性，我们在随机热力学的背景下分析了它们波动的特性36
。如果我们将位移角度的分布作为时间的函数（在AC场周期t的倍数上）进行编译 ，则我们希望转子自然会沿偏置方向和偏向于偏差的方向进行随机步骤（图4D，另请参见图3A）。随机热力学使我们能够研究具有有限轨迹的非平衡系统中的熵产生程度
，从上游和下游过渡速率之间的比率 。表示为从θ0初始位置的周期t旋转的概率，我们期望通过在纳米运动中提取平均熵产生δs在t = nt的时间t = nt（AC场的整数倍数）中 ，通过提取纳米运动的平均熵产生δs来探索不可逆性
，以此 　　其中ωeff和deff分别代表整个随机棘轮动力学的纳米运动器的有效角速度和扩散系数
。有效扩散系数与有效的摩擦系数ζeff有关，该系数取决于非平衡驱动的显微镜机制。请注意 ，公式（1）独立于时间t = nt 。这种关系存在于我们执行的模拟中（图4E）
，并且它也存在于过程旋转电动机的实验数据中（图4F），如所有图通过重新降低斜坡的崩溃而在非平衡情况下的斜率统一线崩溃所见
。在平均平方位移中也可以研究非平衡驱动器 ，该平方位移显示了从扩散行为到弹道行为的交叉（扩展数据图10A）。我们可以对电动机效率进行粗略的理论估计 。当系统针对外部扭矩τ进行操作时
，其净角速度将是，可以从中提取单位时间的有用工作 ，并以标称效率估算
。因此
，可以提取最大的工作，从而导致对标称效率的结合。 　　我们还测试了我们的电动机是否可以在进一步的负载下产生扭矩 。为此 ，我们设计了电动机变体，其中包括枢轴点处的扭转弹簧（图4G
，扩展数据图11和补充图4）
。扭转弹簧由单链DNA环组成，一端固定在基座上 ，另一端固定在转子臂上。转子旋转将在转子枢轴连接周围作为熵弹簧绕圈 。绕组会产生恢复力
，一旦受伤弹簧产生的扭矩平衡了电动机传递的最大扭矩，最终使电动机失速。然后 ，如此张紧的弹簧用作能量储层
，当关闭外部能量供应时，可以将转子沿相反方向驱动 ，直到弹簧再次放松为止
。这种预测的行为与我们观察到的相对应：当交流场打开直到停滞时
，具有扭转弹簧的个体颗粒显示出旋转，然后立即开始在AC场关闭后立即旋转到相反的方向（图4G和补充视频12和13）。 　　总之 ，我们的大分子旋转电动机可以执行工作
，这可以证明它们的持续旋转与溶液中的粘性阻力以及它们结束分子扭转弹簧的能力 。距离每分钟高达250旋转的角速度，并且扭矩高达10 pn nm ，电动机实现了旋转速度和扭矩，这些旋转速度和扭矩正在接近从强大的天然分子机器（例如ATP合酶）中已知的旋转速度和扭矩
。电动机是由于内在的机械性能而定向移动的
，该特性由简单的外部能量调制提供动力，该功能不需要用户提供的任何反馈或信息来指导电动机。我们的电动机还提供了宏观电动机中熟悉的控制选项：用户可以随意打开和关闭它们 ，迅速响应
，并且可以调节旋转的速度和方向 。电动机可以由拥有标准湿lab设备的任何人生产和操作
。足以传输序列信息以使其他用户能够使用从商业来源获得的DNA分子复制和构建自己的电动机。所需的DNA分子的产生可以缩放到质量数量37 。由于DNA折纸成分的模块化，我们希望电动机也可以修改 ，调整并集成到其他情况下
。Gopinath等。最近
，在可编程时尚中描述了如何将其放置在图案的固态表面上3,39 。这些方法可用于构建具有控制定子方向相对于场轴的电动机阵列，以实现同步旋转40
。我们的运动设计和操作概念也可能适用于除DNA折纸以外的其他系统。例如 ，基于蛋白质的旋转组件可能是从头设计的
，可以从头设计，并且可以驱动以通过AC场的方向偏置旋转 。此外 ，而不是电场
，而是 也可以使用其他方向性交替的能源供应，例如交替的流体流量。天然的下一个前沿将是探索通过化学反应引起屏障调节的 ，并使用有向的运动运动来驱动上坡化学合成，以更精致的合成机制具有互补的相互作用运动 - 像F1F0-ATP合成的互动式运动
，机械地合成了旋转运动的ATP驱动
。