冷凝水预膜膜促进紧密结带形成

　　HEK293和MDCK-II（00062107 ，英格兰公共卫生）细胞被培养为二维单层
，在最小的必需培养基中，具有5％的胎牛血清 ，1％非必需氨基酸
，1％的硫酸钠钠，丙酮酸钠和1％抗晶状体 ，而无需与37°C的抗生素添加1％抗体 。在遗传蛋白存在下选择转基因细胞系上的二维单层（400μgml-1）
。在细胞达到70％的汇合后，使用Lipofectamine 2000进行了MDCK-II细胞的瞬时转染。转基因细胞系是由使用NOT-I和ASC-I切割位点克隆的合成基因创建的
，该基因在内部设计的哺乳动物表达质粒（POCC系列），该基因（POCC系列）具有N末端Dendra2 ，一种针对Neomycin-Geneticin和CMV启动子的选择标记 。为了获得稳定的线
，通过荧光激活的细胞分选进行单个克隆选择
。 　　对于二维单层的播种，将400 µL的细胞悬浮液（每毫升为50万个细胞）转移到站立式Transwell滤波器的外侧（Corning 3460）。在无菌环境中 ，将细胞在37°C下粘附30分钟 。之后
，将每个Transwell过滤器安装在一个单孔板上，底部有1 ml培养基 ，内侧为500 µL培养基。 　　对于遵守三维细胞培养囊肿
，将MDCK-II细胞从汇合单层重悬于单细胞悬浮液中
。将Mateck盘（35 mM玻璃底部，P35G-0.170-14-C）的表面涂在37°C下的层粘连蛋白（0.5 mg ml-1）的溶液（0.5 mg ml-1） ，持续1小时
，5％CO2。之后，将20,000个细胞的悬浮液在涂层的涂层表面上播种 ，并在冰上补充5％基质醇 。将细胞培养5-6天，直到直径30-40 µm
。为了测量葡聚糖（Alexa647
，10K）囊肿培养基的渗透性，补充了10μM右旋烷。孵育15分钟后 ，使用共聚焦显微镜对囊肿进行成像
，以评估葡聚糖的分布 。通过测量腔内的强度并将其除以囊肿以外的平均强度来量化葡聚糖进入管腔的渗透性
。 　　CRISPR – CAS9技术用于生成几种单一和双敲入MDCK-II细胞系。ZO-1-MNEON是通过在内源性ZO-1的初始外显子的N末端融合媒体的副本来产生的 。使用表达该融合构建体的细胞系，我们在内源性PATJ或ZO-2的初始外显子的N末端以及Magi-3的羧基末端标记了其他几种带有Mscarlet的支架蛋白 ，以产生双敲门线
。简而言之
，使用在线工具CRISPOR（http://crispor.tefor.net）和chopchop（https：//chopchop.cbu.uib.uib.uib.uib.uib.uib.uib.uib.no）设计了针对每个感兴趣基因的特定CRIS PRNA（CRRNA，IDT）LT-R CRISPR – CAS9 CRRNA）。通过在95°C下孵育5分钟 ，在室温下以1：1的比率将反式激活CRRNA（IDT目录编号1072532）和CRRNA以1：1的比率退火
，以产生导rNA（GRNA） 。所有GRNA都可以在补充表4中找到
。接下来，在PUC57 KAN（Genescript）或Pucidt Kan（IDT）中合成了包含5'和3'同源臂的供体质粒（补充表4）。使用限制性酶通过消化 ，将含有荧光标签（MSC或MNN）的PTISY质粒整合到供体质粒中 。之后
，通过将1μL（10μgμl-1）的重组ALT-R S.P进行混合来组装核糖核蛋白络合物。HIFI CAS9核酸酶（IDT，目录编号1081060）和1μL的GRNA（100μM）与反应缓冲液 ，然后在室温下孵育20分钟
。核糖核蛋白络合物和1μg供体质粒通过电穿孔转染，并与外显子侧重叠。在300,000个细胞中进行每个复合物的电穿孔（Invitrogen Neon电穿孔机和试剂盒
，两个脉冲，20 ms ，1,200 V） 。然后将细胞在六孔板中的生长培养基中铺板
。24小时后交换培养基。电穿孔后48-72小时对细胞进行排序 。富含荧光细胞（MNN或MSC）（一个或两个周期）
， 将单个克隆铺在96孔板的一个孔中
。为了验证遗传修饰，我们首先进行了PCR扩增。通过测序基因分型来验证在感兴趣基因的正确轨迹处的荧光标签的正确插入 。测序证实了标签的纯合插入 ，成像证实了内源性蛋白的MS标记导致在汇合单层中的紧密结带处与MN-ZO-1进行适当的共定位
。 　　为了删除PATJ ∆EXON 3
，我们使用http://crispor.tefor.net在靶向外显子的每个位点上使用了两个GRNA。将GRNA从IDT订购为CRRNA 。将GRNA成对转染，并使用跨越靶向外显子的引物测试了细胞池通过PCR测试了缺失事件
。最佳表现的GRNA对用于细胞克隆。使用跨越靶向外显子的引物筛选单细胞通过PCR筛选删除 。在敲除候选克隆上执行了外面有一个底漆的PCR ，并在缺失内部进行了一个底漆
，以验证缺乏WT等位基因。通过Sanger测序验证了缺失等位基因
。 　　两个克隆的测序证实了第一个外显子的删除，包括导致早期停止密码子的框架移位。蛋白质印迹和定量PCR（QPCR）针对由第一个外显子编码的PATJ的N端L27结构域 ，证实了该域的缺失 。更C末端PDZ4的免疫染色证实
，其余的截短蛋白位于细胞质中，不存在于紧密连接处
。生物分析后使用Qiagen rneasy（74104）迷你试剂盒进行QPCR ，表明底漆的质量很好（补充表4）。 　　使用IMSpector软件（v.16.2.8415）运行的商业共聚焦臭素线STED显微镜（Abberior仪器）进行Sted成像，并带有脉冲激光激发（490 nm
，560 nm，560 nm ，640 nm
，640 nm，40 mHz） ，以及×60 MHz和×60 Water和×100油对象（OLYMP）（OLYMP） 。用脉冲激光在560 nm处成像
，并在640 nm处进行激发
。两种颜色的耗竭激光为775 nm，40 MHz ，脉冲激光（Katana HP
，3 W，1 NS脉冲持续时间 ，NKT光子学）。激发强度
，Sted功率和像素停留时间的最佳组合是通过最大程度地减少强烈光漂白的开始来建立的 。为了降低高频噪声，用二维或三维高斯的Sigma用0.8像素进行过滤Sted图像
。使用MATLAB52编写的自定义软件进行了量化和分割。 　　实时成像动力学是使用配备了Olympus Planapo N×60/1.42物镜 ，SSI Lumencor照明系统和Roper Evolve Evolve EMCCD相机的宽视野三角洲视觉精英系统获得的 。使用配备有Olympus planapo n×60/1.42物镜的宽场通用电动三角洲视觉系统获取扰动实验，而MN和MCH则使用施加的精密Xenon Arc Lamp（V300-Y18）激发
。高分辨率成像是通过使用×60水目标的横视川旋转磁盘场扫描共聚焦系统（CSU-X1 Nikon
，Andor Ixon Ultra）进行的。 　　钙耗尽实验是在具有不同细胞系的MDCK-II的汇合单层上进行的 。在无钙的培养基中生长18小时，直到破坏紧密连接。对于蛋白质组学实验 ，在37°C
，5％CO2的细胞中添加含有钙的培养基，然后在0小时 ，0.5 h
，0.5 h，1 h ，3 h
，3 h和18 h中制备每个样品
。对于实时成像实验，将含有钙的培养基直接在显微镜室的细胞中添加到37°C ，5％CO2上
，并每1分钟成像每1分钟3 h或每30分钟一次成像，持续18小时。 　　将MDCK-II细胞用膜插入物（12毫米 ，0.4 mm孔）接种到康宁的Transwell板中，并在从播种后1小时内在不同时间点测量旋转的耐药性 。使用Millipore（Millicell ERS-2）插入的室顶部和基础部分之间的两极电极电阻系统获得测量
。将电阻乘以Transwell过滤器的生长区域（1.12 cm2）
，并减去无细胞的培养基的电阻，以最终结果在ω×CM2中产生。 　　为了确定ZO-1（％）或每个细胞的ZO-1皮带长度（每个细胞）的覆盖范围 ，我们执行了以下步骤 。我们使用明亮场通道作为输入将单层中的细胞分割
。细胞分割的轮廓用作细胞周长长度。我们通过局部强度阈值对Mn-ZO-1通道进行了分割
，并骨骼骨骼对分段图像进行了骨骼，以使用斐济获得ZO-1带的长度 。由ZO-1覆盖的细胞周围百分比由以下公式计算：外围覆盖范围=（TJ长度/细胞周围）×100％
。使用MATLAB计算每个细胞的ZO-1腰带LZO-1（以μm为μm）的长度如下：LZO-1 = sum（骨架化的ZO-1图像）/单元格。 　　为了确定来自两色时间序列的MS标记的紧密结蛋白的T1/2到达动力学 ，我们对凝结的MN-ZO-1信号进行了分割
，并量化了分段的ZO-1冷凝物中的MSCARLET强度，并且随着时间的推移会随着时间的流逝而定 。使用CellPose（https://github.com/mouseland/cellpose）进行细胞分割 ，然后ZO-1冷凝水分割使用插件减去背景并在斐济中制作二进制
。为了直接纠正光漂白文物
，我们使用自定义MATLAB代码52计算了每个时间点的连接质和细胞质Mscarlet信号之间的比率。假设漂白在空间上是同质的，则该比率独立于漂白 ，并直接报告了浓缩ZO-1（紧密连接）中蛋白质的富集 。使用具有非线性拟合变量斜率（四个参数）的Prism中的HIII斜率模型拟合动力学数据
，以计算每种蛋白质的半Ximimal有效浓度。为了计算客户蛋白到达的T1/2值，我们将动力学数据拟合到山坡模型 ，并确定活细胞中ZO-1和客户端蛋白之间的到达时间差
。 　　使用函数区域绘制ZO-1冷凝物偏心率在分段的ZO-1图像上进行了量化，以测量MATLAB中分段冷凝物的偏心率。偏心率是椭圆焦点与其主要轴长之间的距离之比；它的值在0到1之间 。（在这里
，0和1是退化的情况；偏心率为0的椭圆形是一个圆，而偏心率为1的椭圆是线段
。） 　　为了确定凝结物的扩展 ，随着时间的流逝
，我们使用了fiji54中的插件。分析直接提供了随着时间的推移的长度 。为了量化凝结物中的ZO-1材料的量，随着时间的流逝 ，我们使用了JFILAMENT轨道的分割来测量MATLAB中每个时间点冷凝物的总和强度
。由于JFILAMENT轨道是一维的
，因此我们扩展了分割的宽度以适合冷凝水的宽度。 　　通过以下设置在共聚焦臭虫step显微镜（Abberior Instruments）上进行以下设置进行细胞中的FRAP实验 。在物镜的后焦平面上使用405 nm二极管以100 ms像素停留时间在1.5 mW处漂白了感兴趣的区域
。使用490 nm激光器以5μW的形式获取前漂白和漂白图像。监测次子的荧光恢复1-20分钟，时间分辨率为11 s 。通过使用斐济插件将所有框架的所有帧注册到第一帧中纠正恢复过程中的细胞运动
。 　　HEK293细胞用ZO-1-GFP转染 ，客户用MCHERRY标记。我们测量了ZO-1凝结物内部和外部客户端的荧光强度
，并从这些值中减去了单元外的背景 。 　　裂解物缓冲液中约5μg输入，洗脱和珠的等分试样（10％甘油 ，2％十二烷基硫酸钠（SDS）
，1毫米二硫代硫醇（DTT），1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒鸡肉鸡蛋鸡肉 ，50 mm tris-HCl，pH 8）受到sds-tris-hcl
，pH 8）。Novex凝胶）在90 mV时持续3小时
。IBLOT2凝胶转移系统（Thermo Fisher，IB21001）用于将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上（10分钟 ，20 V）。Ibind Flex系统（Thermo Fisher
，SLF2000）用于通过免疫印迹检测蛋白质水平，并具有以下抗体：IRDYE-800CW链球菌（1：4000 ，Li-Cor
，926322230） 。用700 nm和800 nm的Li-Cor Odyssey系统扫描膜
。在台风FLA 7000扫描系统（GE）中完成了标记蛋白的凝胶荧光（Dendra2）。对于PATJ的蛋白质印迹检测，使用湿系统进行转移（260 mA持续2 h） ，并使用SuperSignal West Pico Plus Chemilumeinumeinmecent底物（Thermo Fisher
，CatalogNo 。34580）在GE Hypermm上（Cytiva，28-9068-50）进行了蛋白质的经典HRP检测
。一抗在4°C的5％牛奶和0.1％的培养基在4°C进行过夜 ，其中PATJ-L27（兔多克隆
，由Le Bivic's Lab赠送）1：200，PATJ-PDZ4（PATJ-PDZ4）（兔多克隆 ，LSBIO，LC-C-C410011）
，LC-C410011），和1：500β-肌动蛋白（1：500β-肌动蛋白（rabbit bitbit）27.ab27 ab2227。在1：5000稀释时使用以下二级抗体：山羊抗兔IgG-HRP（H+L）（细胞信号传导 ，目录
，第7074号）和山羊抗小鼠IgG-HRP（H+L）（细胞信号，Catalog No.7076）（编号为7076）（补充图1） 。 　　二维单层和三维囊肿以相同的方式进行固定
。在室温下用4％多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中固定细胞10分钟 ，然后在300 mM甘氨酸中淬灭
，并在PBS中用0.5％Triton X-100透化10分钟。在室温下，用2％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100在PBS中阻塞细胞 。在阻塞缓冲液中 ，所有原发和二抗的染色涉及在室温下孵育2小时或30分钟
，分别稀释1:50或1：200
。中性蛋白-647（中性素，A-2666和Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯A-20006 ，Invitrogen）的染色（在室温下以1：1000的稀释为1 h
，在阻止缓冲液中以1 h稀释1小时进行染色。原代抗体是PATJ-L27兔多克隆（内部生产），PATJ-PDZ4兔多克隆（LSBIO ，LC-C410011），PALS1小鼠单克隆（Santa Cruz
，SC-365411），ZO-365411 ，ZO-1小鼠IgG1（Invitronal Igg1）Technologies
，71-1500），LIN7兔多克隆（Thermo Fisher ，51-5600）
，E-钙粘蛋白兔IgG（细胞信号，3195s） 。次级抗体是山羊抗小鼠（Abberior ，Star-Red 2-0002-011-2）和山羊抗兔恒星橙（Abberior
，Storange-11102） 　　达到汇合后，将细胞铺在T75烧瓶中 ，并用无钙的培养基取代18小时
，以使细胞能够达到圆形的非极化状态。之后，再次用完整培养基替换培养基 ，并通过向细胞中添加1 mm生物素苯酚30分钟，然后在添加1 mM H2O2 1分钟之前
，在各个时间点进行APEX2标记
。Immediately after, the reaction was quenched on ice by washing three times with 1× PBS supplemented with 10 mM sodium ascorbate (Sigma A4034), 10 mM sodium azide, and 5 mM Trolox ((+/−)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid, Sigma 238813).为了通过荧光显微镜验证生物素化，在此步骤之后立即固定细胞。For proteomics and western blot analyses, cells were lysed by scraping them off the growth surface into ice-cold lysis buffer (2% SDS, 10% glycerol, 1 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8, 1× Protease Inhibitor Cocktail Set III EDTA-Free (EMD Millipore, catalogue no. 539134), supplemented with 10 mM sodium在低蛋白质结合反应管中收集了抗坏血酸盐和5 mm的Trolox 。裂解后 ，使用Pierce 660-NM（Thermo Fisher Scientific
，CatalogNo
。22660）蛋白质浓度检查蛋白质，以确保使用相同的起始蛋白质浓度。 　　使用前 ，用于下拉蛋白质组学实验的所有缓冲液都是在使用前用0.22μm滤波器过滤的 。将冷冻裂解物（1,500 g蛋白）在50 mM Tris
，pH 8中稀释1:10，并将其放置在由0.2％SDS ，1％甘油
，1 mM DTT，1 mM EGTA ，1 mM EGTA
，1 mm EDTA中的孵育缓冲液中，在50 mm Tris-Hcl ，pH 8和1 mm EDTA中，pH 8和1×蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶中的蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶中心
。对于亲和力纯化
，在结合前两次在孵育缓冲液中洗涤约100 L链霉亲和素磁珠（Pierce，PI88817）。将珠子添加到样品中 ，总体积为2 mL
，并在旋转轮的室温下孵育2小时 。接下来，使用磁架将珠子放下 ，并收集上清液并保存以进行蛋白质印迹分析
。用一系列冰冷的缓冲液（每个2 mL）洗涤包含结合生物素化蛋白的每个珠子样品
，以去除非特异性粘合剂。然后用洗涤缓冲液（0.2％SD，1％甘油 ，1 mm DTT
，1 mm EGTA，1 mm EGTA ，1 mm EDTA
，在50 mm Tris-HCl pH 8、1×蛋白酶抑制剂）中洗涤两次，用1 m kCl ，一次是1 m kCl，一次使用50 mm tris-hcl PH 8
，曾经是2 mm kcl的1 mm eDTA，曾经是1 m kCl的30 mm kcl ，曾经是2 mm tris pH 8
，曾经是250毫米 。50 mM Tris-HCl pH8
。生物素化蛋白通过在50μl洗脱缓冲液中煮沸（5％SDS，10％甘油 ，20 mM DTT
，在50 mM Tris-HCl，pH 8 ，1×1×蛋白酶抑制剂）中以95°C进行10分钟
，然后在冰上冷却10分钟。将样品放在磁架上，然后将洗脱株收集在新的管子中 ，用于蛋白质组学和SP3 。将磁珠和10μl洗脱酶进行蛋白质印迹
，以验证质谱前的生物素化实验。 　　为了在相同的定量质谱分析中处理所有时间点，我们使用了基于串联质量标签（TMT）的多重蛋白质组学方法
。TMT同位标记方法通过一方面测量所有样品来实现鲁棒的定量蛋白质组学。这使得统计分析在钙转换跨在所有时间点检测到的钙转换后的不同时间点的相对蛋白质富集 。 　　用二硫代蛋白醇（56°C ，30分钟，10 mm的HEPES
，pH 8.5）减少含半胱氨酸的蛋白
。用2-氯乙酰氨酰胺（室温，黑暗 ，30分钟
，50 mm HEPES，pH 8.5）用2-氯乙酰氨酰胺（室温 ，30分钟
，20毫米，pH 8.5）烷基化的半胱氨酸。使用SP3方案55,56制备样品 ，每个样品在37°C下添加300 ng胰蛋白酶（测序级
，Promega）以进行过夜消化 。根据制造商的说明，将肽用TMT10PLEX同源标签试剂（Thermo Fisher）标记
。简而言之 ，将0.8 mg试剂溶解在42μl乙腈（100％）中
，并加入8μl的储备溶液，然后在室温下孵育1小时1小时 ，并用5％羟胺淬灭15分钟。将样品合并为TMT10PLEX，并将Oasis HLB µELUTION PLATE（水）用于进一步的样品清洁57 。使用配备第四纪泵
，DeGasser，可变波长紫外线检测器（254 nm）的敏捷1200无限液相色谱系统（254 nm）和Peltier-cool-cool portier-cool pool的自动进样器和分数收集器（两者都在10°C下 ，所有样品）
。 　　该柱是带有双子座C18的Gemini C18柱（3μm
，110Å，100×1.0毫米 ，现象）
，4×2.0 mm SecurityGuard（eynomenex）弹药筒作为防护柱。溶剂系统由20 mM甲酸铵（pH 10.0）（A期）和100％乙腈作为流动相（B）组成 。使用以下线性梯度以0.1 mL min-1的流动相流速为0.1 mL min-1：100％A持续2分钟，从100％A到59分钟内的1分钟到35％B ，再到1分钟内的85％B
，在85％B中保持15分钟，然后持续15分钟 ，然后返回到100％A和重新平衡13分钟
。在液相色谱分离期间收集了32个级分
，然后汇集为六个部分。32的第一个和最后两个分数被丢弃，根本不使用 。在真空离心下干燥合并的馏分 ，并在15μl1％甲酸（4％乙腈）中重构，用于液相色谱法
，并结合串联质谱分析。 　　Peptides were separated using an UltiMate 3000 RSLC nano liquid chromatography system (Dionex) fitted with a trapping cartridge (µ-Precolumn C18 PepMap 100, 5 µm, 300 µm i.d. × 5 mm, 100 Å) and an analytical column (nanoEase M/Z HSS T3 column 75 µm × 250 mm C18, 1.8 µm,100Å，水域）
。在30 µl min -1上以恒定的溶剂A（3％二甲基亚氧化二甲基亚氧化二甲基二甲基氧化物 ，0.1％甲酸在水中的0.1％甲酸）的恒定流动到捕获柱6分钟
，进行捕获。随后，将肽通过分析柱洗脱 ，恒定流量为0.3 µl min -1
，其中一个百分比为溶剂B（3％二甲基亚氧化二甲基二甲基硫氧化物，乙腈中的0.1％甲酸）从2％增加到4％ ，在4分钟内增加到8％
，从8％到28％，从28％到40％ ，从40％到40％
，从40％到40％，从40％到40％ ，从40％到40％，从40％到40％ 。2％
。分析柱的出口直接与Orbibrap融合Lumos Tribid质谱仪（Thermo Fisher）
，使用Proxeon Nanoflow源以阳性离子模式。 　　通过PICO-TIP Emitter 360 µm OD×20 µm ID 10 µm尖端（新物镜），将肽引入融合腔腔中 ，其施加的喷雾电压为2.2 kV 。毛细管温度设置为275°C
。在Orbitrap中以375–1500 m/z的质量范围获得了全质量扫描
，分辨率为120,000。填充时间最多为50 ms，限制为4×105离子 。通过将Orbitrap设置为30,000 ，填充时间为94 ms和1×105离子的填充时间
，进行数据依赖性采集
。施用了36的归一化碰撞能。MS2数据以配置文件模式获取 。 　　使用等距和吉祥物（V.2.2.07）来处理获得的数据
。然后将数据与Uniprot Canis lupus蛋白质组数据库（UP000805418）搜索，该数据库包含常见的污染物和反向序列。搜索参数中包括以下修改：氨基甲米甲基（C）和TMT10（k）（固定修改）；和乙酰基（N-期） ，氧化（M）和TMT10（N-Term）（可变修饰） 。为完整扫描（MS1）和MS/MS光谱设置了10 ppm和0.02 DA的质量误差耐受性。最多允许两次丢失的裂解
，并将最小肽长度设置为七个氨基酸
。蛋白质鉴定需要至少两个独特的肽。肽和蛋白质水平的错误发现率（FDR）设置为0.01 。R编程语言（ISBN 3-900051-07-0）用于分析异叠液的原始输出数据
。使用Limma软件包去除潜在的批处理效果。使用VSN软件包将方差稳定归一化应用于原始数据 。与非钙条件（T0）相比，估计不同时间点的单个归一化系数
。使用Limma软件包测试了归一化数据的差分表达式。复制因子包括在线性模型中 。为了比较不同的时间点与T0条件的比较 ，折叠变化大于2的蛋白质被认为是潜在的命中
，而FDR阈值为0.05被视为过滤噪声数据
。此外，由于非相互作用（核糖体 ，核，线粒体
，内质网），我们排除了假阳性命中率（补充表2）。 　　在比较不同时间点的实验中 ，与-T0对照相比
，首先对蛋白质的富集进行了测试 。R软件包FDRTool35使用Limma输出的t值来计算FDR
。FDR小于5％且每次重复的一致倍数变化至少10％的蛋白质定义为命中。GGPLOT2 R软件包用于生成图形 。去除了与非生物素化蛋白的假阳性列表相匹配的蛋白质（补充表3）。RSTUDIO代码改编自先前报道的代码（https://github.com/fstein/ecolitpp）
。使用的r包是Limma（https://bioconductor.org/packages/limma），msnbase（https://bioconductor.org/packages/msnbase） ，tidyyverse（https://tidyyverse.tidyverse.org）(https://bioconductor.org/packages/biobroom), ggrepel (https://cran.r-project.org/web/packages/ggrepel/vignettes/ggrepel.html) and ClusterProfiler (https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/).使用字符串数据库（v.11.5）在Cytoscape（v.3.9.0）中创建了Interactome。细胞定位基因本体论注释来自http://geneontology.org 。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE58合作库存储库沉积在蛋白酶变化联盟中
，并带有数据集标识符PXD052221
。 　　用斐济（https://fiji.sc/）和Matlab（Mathworks）分析图像。所有数据均表示为平均值±S.D.，平均值±S.E.M.或平均±95％置信区间 ，如图传说和结果所述 。n的值和n代表的值（例如
，图像，冷凝物或实验重复的数量）在图中指出了图例和结果
。两尾学生的t检验或单向方差分析用于正态分布数据。统计分析使用Kruskal – Wallis测试与HOC Dunn的多次比较测试 。 　　使用编程语言Python v.3.8.10进行数值计算；所有代码均使用ipython v.7.3.10运行
。该软件已预装在大多数Linux发行版中。OS：Ubuntu 20.04.6 LTS ，64位
，GNOME v.3.36.8 。所有代码和最小数据集可在Zenodo（https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.11174400)52上找到
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。