突触V-ATPase-共鸣素复合物的结构和地形

　　雄性野生型CD1小鼠（23-26天，从Charles River购买）和C57BL/6小鼠（23-26天 ，从杰克逊实验室购买）用于突触囊泡制剂
。SYP - / - 小鼠42是R. Leube的礼物。雄性Syp - / - 小鼠（23-26天龄）用于突触囊泡制剂 。在动物行为实验中
，使用了4-6个月大的野生型黑色6（B6NTAC；从杰克逊实验室购买）和SYP - / - 小鼠的两性
。将小鼠维持在一个殖民地室，其浅色周期为12 h（在07:00开启） ，并随意进入食物和水。 　　将1毫米的小鼠耳朵缺口放入1.5 ml微输出管中
，并用200μl的50 mmol NaOH处理 。将样品在加热块中加热至95°C，持续10分钟
。将管子在冰上冷却10分钟 ，然后添加20μlTris-HCl（pH 8.0）以中和样品。将样品离离心以颗粒
，并使用以下引物立即用于PCR，并使用以下引物：5'-Acttccatctatttcccaccaccacc-3'' ，5'-TTCCACCCACCACCACCAGTTCAGTAGGA-3''''和5'-TCGCGCCTTTTCTTTGACGACGAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGG-3 3.使用以下循环参数：在95°C下3分钟
，35个周期（在95°C下为30 s，在58°C下为30 s ，在72°C下为40 s），在72°C下为3分钟
，并在4°C下保持 。使用1-KB梯子（N3231，NEB）通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物
。野生型WT片段出现在约280 bp（预期的256个） ，而SYP - / - 突变片片段约为650 bp（预期500）。 　　如前所述1,2,12
，制备并纯化野生型和SYP - / - 谷氨酸能ISV 。八只野生型小鼠（仅针对下面指定的野生型Tomo数据1；所有其他野生型数据均来自C57BL/6小鼠）和两只SYP - / - 小鼠被杀死以纯化各自的ISV
。将小鼠的大脑与蛋白酶抑制剂（一个大脑的50 mL 4 mM Na-Hepes（pH 7.4）和320 mM蔗糖； 9 mL）与蛋白酶抑制剂合并，并用“ A” pestle和“ B ” pestle在40 ml倾斜均匀的均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀。将匀浆以880克离心10分钟 。收集上清液（S1）并以12,074克离心15分钟。对于野生型P2颗粒 ，除去上清液（S2）
，将P2颗粒与25 mL均质均匀的缓冲液重悬于蛋白酶抑制剂中，将颗粒的黑暗中心丢弃 ，并将重悬于Resulaspension转移到New Tube
，并转移到27,167G的New Tube，以15分钟为15分钟
。然而 ，由于P2样本量很小
，因此跳过了SYP - / - P2颗粒的离心步骤，遵循了另一种先前发布的协议56。The resulting wild-type pellet (P3) and Syp−/− P2, both of which contain synaptosomes, were resuspended with 5 ml or 1 ml homogenizing buffer and then hypo-osmotically lysed by 40 ml or 9 ml H2O, respectively, followed by adding 1 M Na-HEPES (pH 7.4) and protease inhibitors to achieve a final concentration of 5 mM Na-HEPES.该溶液在40毫升或25毫升的Dounce均质器中均匀3次 ，然后以43,589g离心20分钟 。将上清液（LS1）以256,631克超中心持续2小时
。然后将含有不同类型的突触囊泡的颗粒（LP2）在2 ml囊泡缓冲液（20 mM Na-Hepes（pH 7.4）和90 mM NaCl）中匀浆。通过27尺寸的针头将同质化的突触囊泡进一步机械地造 。使用二甲酸酸测定法测定突触囊泡浓度，并等分等分 在液氮中闪烁
，将其储存在-80°C下直至使用
。 　　为了隔离谷氨酸能突触囊泡，将500μg的LP2级分融化在冰上 ，并用5μg小鼠VGLUT1 vglut1单克隆抗体（135311
，SYSY，SYSY）的封闭缓冲液（囊泡缓冲液+0.5％（w/v）BSA）稀释 ，以实现1 ml的最终体积。将该溶液在4°C下孵育过夜
，然后添加到50μlDynabeads（10004d，Thermo Fisher Scientific）中；在4°C下再孵育颗粒/沉积物2小时 。Dynabeads一次在阻塞缓冲液中洗涤一次 ，仅在囊泡缓冲液中两次洗涤
。然后通过添加25μl40mg ml-1（仅野生型Tomo Data 1
，见下文）或1.1 mg mL-1（对于所有其他野生型和SYP - / - / - / - / - / - / - / - / - / - / - / - ISV数据集合）1 Epcepece1 Epcepece1 Epcepece1 Eptepece1 Eptece1 Epcepepece1，将25μl和1.1 mg mL-1（对于野生型Tomo Data 1 ，仅参见下文）
，通过添加25μl40 mg mL-1（对于野生型Tomo Data 1），将富含免疫的VGLUT1结合的突触囊泡洗脱3次（仅参见下文）或1.1 mg mL-1。我们通过单维CA2+触发的Fusion Assay3测试了ISV类似制剂的功能3 。新鲜制备的ISV的大小和浓度是使用动态光散射（DLS）使用Dynapro纳米级（Wyatt Technologies）确定的
。 　　将野生型LP2 ，野生型ISV，SYP - / - LP2和SYP - / - ISV样品用含有β-甲醇的Laemmli样品缓冲液（1610737
，Bio-Rad）稀释。将样品加载在TGX凝胶（4569036，Bio-Rad）中 ，并用电泳与标准的十二烷基硫酸钠（SDS）跑步缓冲液分离 。为了进行蛋白质印迹分析
，凝胶中的样品通过IBLOT1（Invitrogen）转移到PVDF膜上。为了验证SYP - / - 样品中的SYP耗竭，将膜与主要的抗兔突触蛋白1（1：1,000; 101008 ，SYSY）和二级山羊抗兔IRDYE800CW（1：3,000; 1：3,000; 926-32211
，li-Cor）孵育，以供fluorsence contection Intection Intection i i i;为了检测该膜上的其他突触蛋白以进行公平比较 ，二抗通过还原荧光蛋白质印迹剥离缓冲液（62300
，Thermo Scientific）剥离，并被EveryBlot阻塞缓冲液（12010020 ，Bio-Rad）恢复
。按照制造商的说明
，从蛋白质印迹膜中剥离了初级和二级抗体。我们在1倍剥离缓冲液中孵育探测的印迹15分钟，然后将其在TBST洗涤缓冲液中进行3次洗涤5分钟 ，然后将膜在Everyblot阻塞缓冲液中孵育5分钟，直到重新发行 。将膜与原代抗小鼠SYB2（1：1,000; 104211
，SYSY）和次级山羊抗小鼠辣根过氧化物酶（HRP; 1：10,000; AB6789，ABCAM ，ABCAM）一起孵育
，用于化学发光带检测Ibright1500（Invitrogen）
。对于一个重复（扩展数据图4A），将剥离的膜切成37 kDa ，上膜与主要的抗小鼠SYT1（1：1,000; 105011
，SYSY）和次级山羊抗小鼠HRP（1：10,000; AB6789，ABCAM ，ABCAM
，ABCAM，ABCAM）一起孵育 ，以供化学带iection Interrightright Interright ibright Intright ibright ibright ibright ibright ibright 1（邀请）。 　　为了比较蛋白质印迹中不同的突触蛋白表达水平
，将膜切成对应于20 kDa，约45 kDa和100 kDa梯的切片 。将小于20 kDa的膜切片与原发性抗小鼠SYB2（1：1,000）和次级山羊抗小鼠IRDYE800CW（1：3,000; 926-32210 ，li-cor）一起孵育
。将20–45-KDA膜切片与主要的抗兔Synpr1（1：500; 102002，Sysy）和次级山羊抗兔IRDYEE800CW（1：3,000）一起孵育。将45–100-kDa膜切片与主要的抗兔ATP6V1A（1：500; 39517
，CST）和次级山羊抗兔IRDYEE800CW（1：3,000）一起孵育 。将超过100 kDa的膜切片与主要的抗兔ATP6V0A1（1：1,000; NBP1-89342，Novusbio）和次级山羊抗兔IRDYEE800CW（1：3,000）一起孵育
。膜片中的荧光带是通过Ibright1500成像系统（Thermo Fisher Scientific）成像的。为了分析同一膜上的其他突触蛋白 ，然后将20-45-KDA和45-100-KDA膜切片的二抗体剥离并回收 。按照制造商的说明（62300
，Thermo Fisher），从蛋白质印迹膜中剥离了初级和二级抗体
。我们将探测的印迹在1倍剥离缓冲液中孵育15分钟 ，然后在TBST洗涤缓冲液中将其洗涤3次
，持续3分钟，然后将膜在5％BSA阻塞缓冲液中孵育30分钟 ，直到重新发行。将20–45-KDA膜切片与一级抗兔SYG1（1：500; 103002
，SYSY）和次级山羊抗兔IRDYE800CW（1：3,000）一起孵育，并由Ibright1500成像系统摄影 。将剥离的45–100-kDa膜切片与原代抗兔VGlut1（1：1,000; 135303 ，Sysy）和抗小鼠SYT1（1：1,000）的混合物一起孵育。二级山羊抗兔IRDYE800CW（1：3,000）孵育后
，对VGLUT1的荧光带进行了成像； 在孵育二次山羊抗小鼠HRP（1：10,000）后，对SYT1的化学发光带进行了成像
。 　　使用iBright分析软件（Thermo Fisher Scientific）进行光密度测定法和归一化。 　　新鲜分离的野生型ISV或SYP - / - ISV与或不带有Aurion 10-nm BSA金示踪剂（25487 ，EMS）溶液（V/V = 5/2）的Aurion 10-nm BSA弹药混合 。对于野生型样品，通过使用Fischione Nanoclean 1070 Plasma清洁剂（30-34 W向前功率
，«2 W Refless power and Hydogen offereped of 20 sccm），将带有连续的石墨烯层（石墨烯）（石墨烯）层连续的量化金网格（R2/4 ，300网格）进行了30-40 s
。对于SYP - / - ISV样品
，使用了无需预处理的Quantifoil（R2/1，300粒）金孔 - 碳网格（Q3100AR1 ，EMS）。然后将网格放在定制的湿度室中的parafilm上
，并在腔室的外围添加了大约2 ml Milliq水 。在ISV中，将3.5–4μL施加到网格上 ，并孵育8-15分钟
。然后将网格直接加载到Vitrobot标记I（FEI）上
，并施加另外3μL的ISV。然后通过用定制的特氟龙片或斑点为5，等待时间为22°C和95％的相对湿度 ，将网格置于磁盘上
，用定制的特氟龙片或parafilm替换样品侧面印迹纸 。对于每一轮冰点，我们以1-4 s的变化时间冻结网格
。将网格浸入纯乙烷中 ，并存储在液氮中，直到使用为止。 　　对于野生型ISV的第一个冷冻-ET数据集
，将网格加载到Max Planck生物化学​​研究所300 kV的Max Planck Institute的Titan Krios Transborman Cryo-Electron显微镜（TEM）上，并配备了现场发射枪和Gatan后柱后滤滤器 。使用剂量分馏模式（6.09 e -px -1 s -1剂量速率 ，每架0.33 s暴露时间）通过Gatan K2峰顶直接检测器记录图像
。使用Serialem57以标称倍率为×53,000的Serialem57收集倾斜序列
，导致像素大小为每个像素2.6Å，散焦范围为4.0至5.0μm。使用剂量对称的倾斜度方案58在±60°之间以3°的增量在±60°之间收集了74个 。每个倾斜角度使用相同的曝光时间（每个图像的3.3 s暴露时间和10帧） ，导致每个倾斜系列的总剂量约为120 e -Å -2。我们将该数据集称为扩展数据表中的野生型Tomo数据1
，用于图1B – D和扩展数据中所示的实验图1
。使用Motion Cor259对电影框架对齐，然后使用Motion Crorneffected tilt tilt系列使用IMOD软件包进行托型跟踪与IMOD软件包进行对齐。 　　野生型ISV的第二个冷冻-ET数据集（在图4b ，c和扩展数据中使用图8b
，我们将该数据集称为扩展数据表1中的野生型Tomo数据2）和syp - / - ISV的Cryo-ET数据集（在图4A-C和扩展数据中使用）扩展数据表1）在斯坦福冷冻电子显微镜中心（CEMC）的Titan Krios Tem上收集了扩展数据表，该中心以300 kV的方式运行 ，并配备了野外发射枪和Gatan后柱后能量过滤器 。使用PaceTomo脚本和内置剂量对称的倾斜方案
，使用Gatan K3峰值探测器使用GATAN K3 Summit Direct模式记录野生型ISV和SYP - / - ISV的图像
。野生型ISV（n = 203）和SYP - / - ISV（n = 109）层析成像倾斜序列数据是在低剂量模式下以每个像素为1.1Å的Serialem以低剂量模式的。能量滤波器狭缝宽度设置为20 eV 。使用剂量对称倾斜方案58在±60°之间收集倾斜系列，增量为3°
。散热器设置为1.0–4.0μm ，每倾斜的步骤为0.3μm。每倾剂的剂量为3.4 e-Å2，人均剂量为0.34 e-Å2
，在41个倾斜度上，总剂量为139.4 e-Å-2 。使用MotionCor259对电影帧进行对齐 ，然后使用基于贴片的本地运动对​​准与ARETOMO软件包6​​1对齐运动校正的倾斜系列
。 　　对于所有三个数据集
，使用IMOD软件软件包中的加权后投影方法从对齐的倾斜系列中重建了层次图60。手动检查后，从野生型Tomo Data 1数据集中的52个断层图 ，野生型Tomo Data 2数据集的156个断层图和SYP - / - Tomo Data 1数据集的78个断层图进行了进一步分析 。 　　为了分析图1和扩展数据中所示的野生型Tomo数据1实验
，MATLAB（MATHWORKS）TOM TOOLBOX62用作图像处理的一般平台
。将所有断层图均进行了分组（binning系数= 4，1.4Å每个像素）进行处理。六个用于生成初始模型 。无模板检测方法PYSEG63用于识别膜结合的复合物。简而言之 ，使用模板匹配方法将所有突触囊泡膜分割
，并使用具有不同直径为模板的空心球
。基于离散的Morse理论算法用于追踪与突触囊泡相关的所有密度。根据这些密度的方向和大小选择候选候选物 。对于每个子图，确定了附着膜的正常矢量 ，并围绕该方向产生旋转平均值
。平均值通过亲和力传播方法进行分类。63 。使用Relion（V2）64合并具有清​​晰的膜附着密度的类别以进行约束对齐和分类
。所得结构清楚地显示了V-ATPase（扩展数据图1A）。 　　然后
，将所得的结构用作新模板，以使用PYTOM65执行新的模板匹配 ，但是这次使用所有BINNED断层图 。将最终的命中手动排序以生成最终数据集
。总共从52个断层图中鉴定出1,860个V-ATP酶。随后，未键（全尺寸）断层图用于分类和平均 。用WARP66提取了192×192×192像素体积的子图表
，该图为每个子图生成了3D对比传递函数（CTF）模型
。使用RENION（V2）64的3D断层扫描工作流进行分类，并在胞质域中涂上软面膜。鉴定出胞质结构域的三种不同构象 。最终的细化使用了软面膜 ，包括整个分子组件。使用经纱-M67应用了另一轮多粒子细化
，将其进一步完善了倾斜系列比对参数
。对于每个子图，仅包括前15个枯草（45 e -2累积剂量）进行最终重建和分辨率估计。根据金色标准的傅立叶壳相关性 ，使用0.143标准确定分辨率68 。 　　为了可视化ISV膜
，我们首先使用了基于张量投票的自动跟踪方法69
。随后，使用Amira软件（Thermo Fisher Scientific）进行任何必要的手动校正。V-ATPase组件位于其本地位置和方向 。该定位利用了低通滤波的重建图和从子图平均（图1B）或模板匹配（图4A）获得的Euler角度信息
。Chimerax用于生成图1和图2中所示的最终效果图。1B（右）和4A（右） 。 　　将来自野生型Tomo数据1的V-ATPase图过滤为30Å ，并用作野生型Tomo数据2和SYP - / - Tomo Data 1 Tomograms中V-ATPase组件鉴定的模板
。模板匹配是在pytom65上对BINNED断层图（Binning系数= 8
，8.8Å）进行的。然后使用pycresta过滤断层图（示例在扩展数据中图8a，b） 。Wiener滤波以3.0μm的散焦设置和信噪比的偏差为0.9进行
。另外 ，横线图是通过Cryocare38剥落的
，而无需维也纳过滤（图4A中是一个例子）。在Wiener过滤和冷冻保健地图中手动检查模板匹配结果 。 　　两个人独立检查了两组断层图，并计算了ISV完整和仅V0的仅V0 v-ATPase组件的拷贝数（补充表4和5）。对于完整的V-ATPase ，我们检查了1,326个野生型ISV和1,453 SYP - / - ISV
。对于仅V0的V-ATPase，我们检查了较小数量的ISV
，因为识别较小的仅V0的组件（分别为106个野生型ISV和188个SYP - / - ISV）更加耗时。 　　为了进行统计显着性测试，我们通过随机重新采样来使用自举统计过程 ，以替换四组的每个ISV的观察到的拷贝数（扩展数据图8D
，e） 。每个组重复此过程10,000次，导致每组的V-ATPase拷贝数的10,000个模拟分布产生
。计算每个拷贝数和组的平均值和标准偏差。使用学生的t检验评估统计显着性 。所有分析均使用R软件进行
。 　　为了将泊松分布拟合到四个组中每一个的拷贝数中 ，使用了至少一个完整或仅V0仅V0 v0的ISV（扩展数据图8F – I）。使用Python脚本中实现的最小二乘方法估算了观察到的拷贝数和泊松分布之间的比例因子以及泊松分布的λ参数 。对于完整的V-ATPase组件的情况
，泊松拟合预测没有完整V-ATP酶的ISV的数量，并表明我们的观察结果高估了没有完整V-ATPase的ISV的数量
。高估程度很大程度上是由于缺失的楔形效应。相反 ，缺失的楔形效果还表明
，我们低估了拷贝数的完整V-ATP酶的数量≥1 。但是，拟合的泊松分布的λ参数应独立于V-ATPase的丢失的分数 ，因此它代表了每个ISV的真实平均拷贝数
。对于V0组件的情况
，适用类似的参数。但是，在野生型ISV中 ，没有V0组件的ISV数量没有高估，这可能是由于计数V0组件的略有不确定性所致 。所有计算均使用Python（v3.8）的Scipy模块进行。 　　对于水疗数据收集
，使用Serialematialemation Software 57使用Stanford CEMC的Titan Krios Electron显微镜（Thermo Fisher Scientific）对配备了K3摄像头（GATAN）的Titan Krios Electron显微镜（Thermo Fisher Scientific）对具有野生型ISV和SYP - / - ISV的冷冻网格进行成像
。名义放大倍数为×81,000，物理像素大小为1.1Å。在每个阶段位置 ，使用多个记录设置对四个或九个孔进行成像
，每个孔都包含三个或四个成像点 。在每个成像点收集了一个50帧的电影堆栈，总曝光时间为4.0 s
。剂量速率约为15.5 e -px -1 s -1 ，每帧暴露时间为0.08 s；一个电影堆栈的总剂量为50 e -Å2。 　　在Relion（v3.1）70中对野生型ISV的所有图像进行了预处理 。总共收集了21,577部电影并与MotionCor259对齐
，并根据CTFFIND471的平均框架的平均值估算了CTF参数
。我们将topaz72用于粒子拾取。在颗粒中，从108个显微照片中手动挑选了524个明显完整的V-ATP酶进行训练集 。使用此训练组 ，Topaz从4,404个显微照片中选择了33,094个颗粒
。然后
，我们与Relion进行了几轮2D和3D分类，返回了4,461个完整的V-ATPase候选者。3D分类的初始模板是从先前的Work41获得的 。使用这些颗粒重新培训 ，并从整个数据集返回321,087个颗粒
。经过几轮2D和3D分类后
，保留了77,779个颗粒以进行进一步分析。为了对这些颗粒进行分类，我们采用了完整V-ATPase组件的细胞质区域的软膜 ，这导致了三个类，代表了V-ATPase的三个状态 。通过几轮改进
，CTF精致，后处理和贝叶斯抛光 ，进一步提高了地图质量。接下来
，将这些颗粒导出到CryoSparc（v3.2）73中，其次是不均匀的细化 ，这使得所有三个状态的总体分辨率均为4.3Å
。对于仅V0的V-ATPase组件
，使用Topaz的13,036个显微照片中的粒子拾取的模板，将来自完整V-ATPase 2D类的仅重新固定的V0仅重点的2D类用作模板。总共通过几轮2D分类选择了总共4218个颗粒来重新培训TOPAZ选择器 。最终 ，选择了699,268个颗粒
，然后采集一系列连续步骤：2D分类，3D分类 ，3D细化
，CTF细化，后处理 ，后处理和贝叶斯抛光
。随后将精制的颗粒导出到冷冻物中。精炼不均匀后（将初始低通分辨率设置为12Å）， 总体分辨率为3.8Å 。 　　在CryoSparc（v4.4）73中对SYP - / - ISV的所有图像进行了预处理
。总共收集了20,027部电影并与斑块运动校正对齐
，并根据贴片CTF估计的对齐帧的平均值估算了CTF参数。同样，我们将topaz72用于V-ATPase粒子拾取 。在颗粒中 ，从327个显微照片中手动挑选了179个明显完整的V-ATPase组件进行训练集
。我们使用此训练套件从3,500个显微照片中挑选了47,880个颗粒
，然后在CryoSparc中进行了几轮2D分类，总共返回了10,860个颗粒。使用这些颗粒对黄玉进行了重新训练 ，并从整个数据集中挑选了423,510个颗粒 。经过几轮2D分类后
，将137,987个颗粒导出到关系中（v4.0）74，以进行进一步的3D分类
。为了对这些粒子进行分类 ，没有偏差
，我们首先使用了一个柔软的掩码，该遮罩是从野生型ISV中完整的V-ATPase组件图中得出的。使用V-ATPase的细胞质区域的软膜进一步对产生的84,686个颗粒进行了进一步分类 ，从而导致三类代表V-ATPase的三个状态 。通过几轮改进
，后处理和CTF的细化，进一步提高了地图质量 ，这使三个地图分别分别为1、2和3的分辨率为4.5 、4.4和4.5。对于SYP - / - ISV中的仅V0的V-ATPase组件，我们使用了野生型ISVS数据集的仅V0的TOPAZ模型
，并从13,036个显微照片中挑选了粒子
。总共采摘了639,377个颗粒，然后进行两轮2D分类。为了进一步对这些粒子进行分类 ，我们使用了2D分类的91,542个粒子来从头开始重建四个类别
，一个诱饵类由2D分类的粒子组成 。然后，我们将这五个类应用于91,542个颗粒的异质填充模板 ，返回56
，885个用于3D分类的颗粒，并选择了53,390个颗粒 ，用于在冷冻PARC中进行进一步处理：非均匀的细化（初始低通分辨率设置为30Å
，用于杂片精制的地图），全球CTF细化 ，局部CTF
，局部CTF，局部改进 ，局部改进和非均匀的改进（用于局部低通索图）（用于局部低通索图（用于局部低通索图），以设置为12Å（设置为12Å12Å）
。SYP - / - ISV中仅V0仅V-ATPase组件的最终精制图的分辨率为3.6Å。 　　所有傅立叶壳相关曲线均使用独立完善的半图计算
，并使用0.143标准评估了分辨率，并校正了掩盖效果 。通过CryoSparc中的局部分辨率估计方法估算了所有野生型图和仅V0仅V0的v0 v-ATPase图的局部分辨率
。使用局部分辨率方法估算了SYP - / - ISV的完整V-ATPase图的局部分辨率。使用Chimerax进行了局部分辨率图（扩展数据图2F和4F）的可视化 。使用Relion 3D细化和CryoSparc非均匀细化结果中的Euler角度 ，评估了完整和仅V0仅V0 v-ATPase组件的最终图（扩展数据图2G和4G）的最终图
。 　　从收集的SPA和断层图中收集的显微照片估计ISV的直径。对于每个断层图
，通过沿Z轴的强度求和产生了一个2D投影 。对于每个ISV，至少包含一个完整或仅V0的V-ATPase ，手动选择了其膜边缘的三个点
。然后
，根据这些点拟合一个圆，以计算ISV的直径。 　　基于沉积的大鼠（PDB IDS：6VQ6
、6VQ6、6VQ7 、6VQ8和6VQH）和人类（PDB IDS）和人类（PDB IDS：6WM2
、6WM2、6WM3 、6WM3
、6WM4和6WM4和6WLW）V-AND鼠标和6WM4和6WLW） ，生成了野生型（鼠标）ISV SPA数据的V-ATPase和突触蛋白复合物的初始模型 。Alphafold229。根据使用COOT75的小鼠序列突变模型后
，使用Chimerax76将模型作为刚体拟合到冷冻em图中
。在将这些模型进口到Chimerax内的ISOLDE77之前，对这些模型进行了调整 ，以调整Sidechain Rotamers。使用COOT和PHENIX（V.1.21）78通过多轮改进来评估最终模型
，并用Emringer79验证 。基于先前的工作18对V-ATPase组件的其余区域的原子模型进行建模，然后根据使用COOT的小鼠序列进行突变
。然后将所得的模型固定在嵌合体中 ，然后用Coot和phenix进行完善。在使用Phenix的最后一轮真正的空间改进中，我们使用了const_shrink_donor_acceptor = 0的非默认设置
，nonbonded_weight = 500，以及use_neutron_distances = true 。出于说明目的 ，生成了三个旋转状态的复合模型
，并遵循与以前的工作相同的策略18
。 　　对SYP - / - ISV中完整和仅V0的仅V0的V-ATPase组件的结构与我们的野生型结构进行了类似的建模，我们的野生型结构涉及Rosetta80,81自动重塑 ，这是由Coot和真实的空间细化和ADP Repinement和pentix对pentix进行迭代手动调整。在使用Phenix的最后一轮真正的空间改进中
，我们使用了const_shrink_donor_acceptor = 0的非默认设置，nonbonded_weight = 500 ，以及use_neutron_distances = true 。 　　我们使用Chimerax静电功能来计算V-ATPase-共鸣素复合物的界面区域的静电电位
。 　　为了了解对结构变化的见解
，我们计算了所有野生型和SYP - / - 模型的根平方差异（RMSD）（RMSD）的完整和仅V0仅V0的V-ATP酶（补充表3）。我们将完整V-ATPase的状态2用于PDB IDS 6WM3、7U4T，6VQG和7UNF ，作为7UNF沉积仅包括状态2 。这些模型以及SYP - / - 模型在全球范围内与野生型模型进行了整齐
，并随后使用rmsd型型号计算了一个定制的pyty pytypy pytypy pytypy
。用colorbyRMSD函数在Pymol中可视化RMSD。 　　为了从ISV样品中获取蛋白质的综合列表，我们使用了高分辨率质谱样品样品制备和液相色谱 - 潮汐质谱法（LC – MS/MS）方法 。简而言之 ，我们将100μl的6 m GDMCL，10 mM TCEP
，40 mM CAA和100​​ mM Tris（pH 8.5）缓冲液加入了三种不同的ISV制剂（每个26μg）。将裂解物在95°C孵育5分钟，并短暂涡旋
。使用二甲酸测定法测量蛋白质浓度。然后 ，通过胰蛋白酶在37°C的蛋白质与酶比为50：1的胰蛋白酶在37°C下过夜消化样品 。通过添加1％三氟乙酸（TFA）来制止消化
，并使用绿洲HLB弹药筒（每10毫克1 cc，水域）清理样品
。通过速度VAC将消化的肽样品干燥 ，并在100 mM碳酸氢苯甲酸铵（TEAB）中重新溶解
，并用供应商指示的串联质量标签（TMT）10PLEX试剂（THEMERO FISHER SCIENTIFIFIFIFIFIC）标记，并由供应商指示 ，随后以相等的量组合。 　　水2D LC（Waters McLass 2DNLC）用于肽分离 。通过在第一维的高pH下通过逆相色谱法分离肽
，然后在第二维处的低pH下进行正交分离
。在第一个维度中，移动相是缓冲液A（pH 10时20毫米铵甲酯）和缓冲液B（乙腈）。使用12个不连续的台阶梯度在2 µL min-1的BEH 300 µM×5 cm C18 5.0 µm柱（水）上分离肽 。在第二维中 ，将肽加载到内部包装的75 µm ID/10 µm尖端ID×28 cm C18-AQ 1.8 µm AQ 1.8 µm带缓冲液A（水中0.1％甲酸）
。用梯度从5％至40％缓冲液B（乙腈中的0.1％甲酸）分离
，在180分钟内，流速为300 NL min -1。液相色谱系统直接与Orbitrap融合Lumos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）直接耦合 。 　　源以1.8–2.2 kV的速度运行 ，以在275°C下用离子转移管优化纳米喷
。质谱仪以数据依赖性模式运行。在Orbitrap质谱分析仪中从400至1,500 m/z中获得了全质谱扫描，分辨率为120,000 。用0.7 m/z的隔离窗口分离前体
，并在快速模式下以35％能量在35％能量下碰撞诱导的解离。MS1自动增益控制（AGC）为4×104；MS2 AGC为104
。最大注射时间为100 ms。随后，选择了八个片段离子进行MS3分析 ，以1.6的m/z窗口分离
，并以65％能量的较高能源碰撞解离（HCD）碎片 。以60,000的分辨率在Orbitrap中检测到所得片段，最大注射时间为150 ms或直到达到105的MS3 AGC目标值
。 　　获得的原始数据是使用蛋白质组发现者（Thermo Fisher Scientific）处理的。前体离子使用10 ppm的质量耐受性和0.6 da用于碎片离子 ，用于块状肌肉蛋白蛋白数据库搜索 。该搜索包括半胱氨酸氨基甲基化作为固定修饰
。在蛋白质N末端
，蛋氨酸氧化和肽N末端和赖氨酸的TMT的乙酰化用作可变修饰。胰蛋白酶消化允许多达两次错过的裂解 。仅考虑至少六个氨基酸的独特肽用于蛋白质鉴定
。肽错误发现率设置为小于1％。从Uniprot搜索了鼠标数据库的数据 。排除了超过50％干扰的光谱以进行随后的定量分析
。最终蛋白质列表（总共2,687个蛋白质候选；补充表1）使用了两个过滤器：（1）具有两个以上独特肽的蛋白质；（2）它被标记为主蛋白。 　　为了鉴定ISV中V-ATPase亚基E的同工型，我们在质谱样品样品制备中使用了胰凝乳蛋白酶 。在三种不同的ISV制剂中 ，每个ISV制剂中的每一个中
，将5 µg转移到新管中，并使用10％SDS/100 mM茶具归一化为50μL。然后将样品用10 mm的二硫索醇（DTT）在55°C下冷却20分钟 ，冷却至室温
，然后用30 mm丙烯酰胺烷基烷基酯30分钟
。然后将它们用2.6μl的27％磷酸和165μl的S-trap载荷缓冲液（90％甲醇/10％1 M茶具）酸化至pH〜1，并加载到S型捕集微综合体（Protifi）。加载后 ，将样品分别用90％甲醇/10％100 mm茶具，90％甲醇/10％20 mm茶具和90％甲醇/10％5 mm Teab溶液的100％甲醇/10％甲醇/10％甲醇
，90％100毫米茶具，90％100 mm茶匙进行依次洗涤 。将样品在47°C下用600 ng的质谱级胰蛋白酶（Promega）消化2小时
。然后 ，用两种35μl的甲酸在水中用0.2％甲酸和两次40μl的80％乙腈增量
，在水中用0.2％的甲酸增量洗脱消化的肽。将四个洗脱液合并为1.5 ml S型捕获恢复管，并通过SpeedVac（Thermo Fisher Scientific）干燥 。最后 ，将干燥的肽在2％乙腈中以水中的0.1％甲酸重构进行LC -MS分析
。 　　使用内部拉动和填充的反相分析柱（约25 cm长
，内径为100μm），将蛋白水解消化的肽分离 ，并将Maisch Dr. Maisch 1.9-μmC18珠作为固定相。用80分钟的反相梯度（2-45％B
，然后进行高B洗涤）在Acerity M级UPLC系统（Waters Corporation）上进行分离，流速为300 nl min-1 。流动期A在水中为0.2％甲酸 ，而流动相B则为0.2％乙腈中的甲酸
。通过电喷雾电离形成离子
，并通过Orbitrap Exploris 480质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行分析。使用HCD碎片以MS/MS光谱生成的HCD片段化以数据依赖性模式运行质谱仪 。 　　使用Byonic V5.1.1（蛋白质指标）分析原始数据，以鉴定肽并推断蛋白质
。含有Uniprot usus musculus蛋白质以及其他可能的污染物和杂质的串联Fasta文件用于生成在硅肽库中。假定用胰胆红蛋白的蛋白水解为半特异性 ，可以进行n个碎裂的裂解，最多可带两个遗漏的切割位点 。将前体和片段离子公差设置为12 ppm。用丙酰胺修饰的半胱氨酸被设置为搜索中的固定修饰
。可变修饰包括对蛋氨酸的氧化
，色氨酸上的脱氧化，谷氨酰胺和谷氨酸环化以及N末端乙酰化。使用标准的反向型技术82 ，蛋白质的蛋白质被认为1％的错误发现率 。最终确定的蛋白质清单（补充表2）使用了两个过滤器：（1）鉴定的肽是唯一的；（2）根据Byonic的得分算法83
，频谱得分大于300
。 　　使用UCSF Chimera从完整的（状态3）的SPA图（状态3）或仅V0的仅V0的V-ATPase组装中手动提取结合伴侣密度。将提取的地图放在100个PX3盒中，像素大小为1.1Å 。Alphafold229预测与高分辨率质谱检测的ISV蛋白相对应的原子模型已下载
。使用SITUS软件包30,31中的彩色程序进行了无偏匹配 ，分辨率为6Å
，搜索度为15，而MAP轮廓分别为0.01或0.004 ，分别用于完整或仅V0的分段额外密度映射。对匹配的评分和对不均衡的颜色互相关得分（CCSS）（补充表1的2–2,641行）进行了评分和排名 。没有AlphaFold2预测的其他49种蛋白质（补充表1的2,642–2,694行）
，但它们的大小太大，要么不知道是突触膜蛋白
。此外 ，检查并忽略了一些导致不切实际的CCS值（超过1个）的大型结构。与CHIMERAX中的目标密度单独检查了具有合理CCS值（少于1）的前200个命中 。非膜蛋白或没有膜结构域与膜区域中观察到的结合伴侣密度匹配的候选者被忽略以进行进一步分析
。在看起来合理的人中
，我们使用Chimerax进行了刚性调整拟合度。然后，我们通过将居住在结合伴侣密度之外的Cα原子的数量与Cα原子总数归一化来计算使用Chimerax的异常值百分比 。最终 ，最终的顶级候选者是使用异常值的百分比作为标准，是SYG1
，Synatogyrin-3，s依诺oporin和Synataptophysin。 　　每种基因型的小鼠在4到6个月大的年龄之间进行测定
。在实验当天称重所有小鼠 ，并从新鲜制备的5 mg ml-1 PBS溶液（n = 9野生型和n = 6 syp - / - 鼠标）中腹膜内服用25 mg-kg-1海藻酸。立即将小鼠放置在圆柱观测室中
，并实时监测和评分 。根据先前定义的Racine 6或8，观察行为是盲目评分的84
。使用GraphPad Prism中的生存对数秩（Mantel – Cox）测试比较潜伏期曲线。 　　We used AlphaFold229, Amira (v2020.2; Thermo Fisher Scientific), AreTomo (v1.3.4)61, Byonic by ProteinMetrics (v5.1.1)83, Chimera (v1.16) and ChimeraX (v1.3 and v1.7)76, cryoSPARC (v3.2 and v4.4)73, CTFFIND471,Ibright1500分析软件（v5.2.2; Thermo Fisher Scientific） ，Emringer（v1.0.0）79
，IMOD（v4.11.3）60，Isolde（v1.3）77 ，MotionCor259
，Phenix（V1.21）（v1.21）78，Prism（V10.2.2; GraphPad; GraphPad Software） ，Protecricome dofermoe doversemer（pycrestrica doversity;(https://github.com/brungerlab/pycresta), PyMol (v2.3.2; Schrödinger, LLC), Python (v3.8), PySeg (v1.0.0)63, PyTom (v0.981a and v1.1)65, R (v3.4.2), RELION (v2, v3.1 and v4.0)70,Rosetta80
，Scientific Xcalibur（v4.1; Thermo Fisher Scientific），Serialem（v4.0和v4.1）57 ，Situs（v3.2）31，Topaz（v0.2.5）72和Warp（v1.0.9）66 。可以在https://github.com/brungerlab/isv_scripts上找到几个脚本文件
。 　　所有动物程序均根据《美国国家卫生研究院指南和使用实验室动物的护理和使用指南》进行
，并由斯坦福大学实验室动物护理机构指南行政小组批准（协议29981）和科罗拉多博尔德大学的机构动物护理和使用委员会（协议1106.02）。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量，但是本研究中描述的实验至少对每组至少3-9个样本进行 。自举统计过程是通过随机取代重复序列来完成的（扩展数据图8D ，E）
。两个人独立检查了断层图的两半
，并计算了每ISV的V-ATPase的拷贝数（图4B，C）。小鼠观察行为被两个人盲目评分（图4D） 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。