肺泡巨噬细胞通过中性粒细胞衍生的12-Hete的新生儿印迹

　　C57BL/6只小鼠 ，Alox15 - / - 小鼠（B6.129S2-Alox15TM1FUN/J）
，Alox5 - / - 小鼠（B6.129S2-Alox5tm1fun/J）（B6.CG-TG（S100A8-CRE，-EGFP）1ILW/J） ，CSF2RB - / - 小鼠（B6.129S1-CSF2RBTM1CGB/J）和K18-HACE2和K18-HACE2（B6.CG-TG（B6.CG-TG（K18-ACE2）2PRLMN/J）。通过将K18-HACE2小鼠与Alox15 - / - 动物交叉
，产生ALOX15 - / - K18-HACE2小鼠 。C57BL/6背景上的Alox15lox/Lox小鼠是S. Tersey（美国芝加哥大学）的礼物，并与MRP8CRE小鼠交叉 ，以产生中性粒细胞中Alox15途径的特定缺失
。C3HEJ背景上的LTB4R2 - / - 小鼠是C. Brown（美国密苏里大学）的礼物。所有动物均在麦吉尔大学研究所的动物设施中饲养并在特定的无病原体条件下
，并随意进入食物和水，温度为21°C（±1°C） ，相对湿度为40-60％（±5％）（±5％），光周期为12 h
，在12 h，12 h ，每日循环（每日周期） 。将小鼠随机分配给实验组
，并使用雌性和男性和性别匹配的小鼠进行实验
。 　　使用冷的无菌PBS（成年小鼠5×1 mL； PND3的5×50–100 µL）通过幼稚小鼠的BAL收集AM。在补充10％（v/v）FBS，2 mM-谷氨酰胺 ，10 mM HEPES和100 U ML – 1 Penicillin -1 Penicillin -strepthepycin的RPMI -1640培养基中培养AM 。粘附1小时后
，用PBS洗涤AM并将其放置在新鲜的培养基中
。小鼠BMDM在胫骨和6-8周大的小鼠的无菌冲洗后分离出来。在补充的RPMI-1640中，将巨噬细胞与BM前体分开了6天青霉素 - 链霉素 。通过使用冷的无菌PBS对幼稚小鼠腹膜灌洗来收集PM。在补充10％（v/v）FBS ，2 mM-谷氨酰胺
，10 mM HEPES和100 U ML – 1 Penicillin -1 Penicillin -streptomycin的RPMI -1640中培养PM
。粘附1小时后，用PBS洗涤PM并将其放置在新鲜的培养基中。与细胞培养有关的所有试剂和补品均购自Gibco 。 　　所有流感在体外和体内感染均使用流感A/Puerto Rico/8/34（H1N1）病毒进行 ，该病毒由J. A. McCullers（St Jude Children Research Hospital）提供
。使用标准牙菌斑测定37将病毒传播并滴定在MDCK（ATCC）细胞中。鼻内挑战（在25μlPBS中）
，IAV以20或50 p.f.u.（免疫表型，ELISA）或90 P.F.U.的致命剂量（LD50）中位数（LD50）在某些实验中 ，ALOX15 - / - 小鼠用MPGES1的化学抑制剂（CAY10526，5 mg kg – 1）在100 µL PBS中
，每天）或外源性12-HETE或15-HETE或15-HETE（100 µg PBS 100 µL PBS中的100 µL PBS）中对ALOX15 - / - 小鼠进行治疗 。使用标准MDCK斑块测定法在PBS中均质匀浆中测定病毒滴度
。 　　对于体内SARS-COV-2感染，从魁北克蒙特利尔的麦吉尔大学健康中心的患者中分离出SARS-COV-2/RIM-1。SARS-COV-2在VEOE6细胞（ATCC）中传播 。如先前所述的38含有4,000个中位组织培养感染剂量（TCID50）的SARS-COV-2/SB2的中位组织培养剂量（TCID50）
。 　　在特定的实验中 ，用100 ng ml – 1的LP（Sigma）或AMS刺激AMS
，PMS或BMDMS用50 µg ml -1的poly（i：c）（Invivogen）刺激。 　　BAL样品通过用22号套管插管气管收集，然后用3×1毫升冷的无菌PBS洗涤肺 。灌洗后回收的流体的总体积约为0.7毫升
。离心样品（1,500 r.p.m. ，10分钟）
，并使用Pierce BCA蛋白测定法（Thermofisher）评估总蛋白质含量。 　　从天真或IAV感染的小鼠（50 p.f.u.，感染后第6天）收集肺 ，并小心去除血液凝块 。然后称重肺（湿重）
，在烤箱（56°C，2天）中干燥 ，并测量干重。数据表示为湿/干（W/W）的比率
。 　　在胶原酶IV消化（150 U ML – 1
，Sigma）在37°C下灌注10 mL的PBS，在胶原酶IV消化（150 U ML – 1 ，Sigma）之前灌注并切碎。通过70 µM尼龙网滤波肺，并裂解红细胞 。用5 mL冷PBS腹膜内注射的5 mL冷PBS灌洗后获得腹膜细胞
。然后将细胞旋转
，并裂解红细胞。通过通过70 µM尼龙网将脾脏粉碎脾脏，然后进行红细胞裂解来获得脾细胞 。用胶原酶VIII（1 mg ML – 1 ，Sigma）分解和消化后
，在37°C下进行了30分钟，从而获得了肝细胞（中间叶）
。在红细胞裂解之前 ，细胞依次通过100和70 µM细胞滤网。通过100和70 µM细胞滤网
，然后是Percoll梯度（30％和70％的溶液），获得了脑细胞 。总肺 ，腹膜
，肝脏，脑和脾细胞计数用血细胞计确定 ，并使用1-20万细胞进行染色
。 　　在0.5％BSA/PBS溶液中
，用活力染料E450或E506（Invitrogen，20分钟 ，4°C）对细胞染色，并用抗CD16/32（BD Bioscience）染色
，以阻止与FC受体（10分钟，4°C）的非特异性AB相互作用。Cells were then surface-stained with different combinations of PE-Cy7-conjugated anti-CD11c, PE-CF594-conjugated anti-Siglec-F, PE-Cy7-conjugated or BUV395-conjugated anti-CD11b, PerCP-eFluor710-conjugated anti-Ly6G, FITC-conjugated or APC-conjugated anti-Ly6C,APC-EFLUOR780偶联的抗F4/80 ，PE偶联的抗CD103
，PERCP偶联的抗CD64，BUV395偶联的抗CD45.2和APC偶联的抗CD45.2和APC结合的抗CD45.1（全部来自BD Biosciences） 。对于Ki-67 ，p53
，PSTAT5，PSMAD2/3 ，P-P38
，PAKT和PERK1/2，细胞被固定并使用BD Cytofix/cytoperm（BD Bioscience）在用APC结合或PE-Conjugated或PE-Conjugated Anti-Ki-67 ，Pei-Consatt Ant-Ponated Ant-Ponjug53之前
，使用BD Cytofix/cytoperm（BD Bioscience）通透AlexaFluor647-conjugated anti-p-p38, PE-conjugated anti-pSMAD2/3, APC-conjugated anti-pAKT1, PerCP-eFluor710-cojugated anti-pERK1/2, PE-Cy7-conjugated anti-p-γH2AX, AlexaFluor 647-conjugated anti-15-lipoxygenase andAPC偶联的抗PSTAT5（来自BD生物科学，生命技术 ，生物群或细胞信号技术）
。在某些实验中，对线粒体活性氧的产生或DAPI（PBS中的1：2,000）染色（Invitrogen）进行染色
，以评估总DNA含量。使用FACSDIVA软件v.8.0.1（BD Biosciences）使用BD LSR Fortessa X-20仪器（BD Biosciences）（BD Biosciences）进行流式细胞仪 。使用FlowJo软件v.10.7.1（树星）进行分析。 　　根据制造商的指示，使用PE-ANNEXINV和7-氨基 - 肌动霉素D（7-AAD）凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences）评估了BAL AM的坏死和凋亡水平 ，并根据制造商的指示和流动细胞仪对其进行分析
。 　　为了进行体内分析
，在安乐死前7天，将BRDU腹膜内腹膜内（每只小鼠1毫克1 mg）进行。在通过制造商的说明中 ，使用BRDU APC套件（BD）评估了AMS和PMS中的BRDU掺入
，然后通过流式细胞仪分析 。 　　为了进行体外分析，在GM-CSF（20 ng ML – 1）刺激后 ，将BRDU（10 µM）添加到AMS中
。在第3天
，用4％多聚甲醛（PFA）固定AM，然后在室温下使用1.5 M HCl将DNA固定30分钟。用PBS洗涤细胞 ，然后用抗BRDU抗体染色（Biolegend） 。在BMDM分化的第3天和第5天
，将BRDU（10 µM）添加到细胞中
。按照制造商的说明，使用BRDU APC试剂盒（BD）在第6天通过流式细胞仪评估BRDU掺入。 　　将肺膨胀并用福尔马林10％固定48小时 ，然后嵌入石蜡中 。切割切片（5μM），用甲氧精和曙红染色
。将载玻片以×40放大倍率的分辨率进行扫描
，并使用Leica Aperio幻灯片扫描仪（Leica）拍摄图片。 　　对于冷冻切片，ALOX15和LY6G染色 ，将肺在PBS中用10％OCT膨胀
，并在OCT中嵌入OCT，然后在-80°C冷冻 。将切片（5 µm）在玻片上干燥 ，并在冰冷的丙酮中固定5分钟：甲醇溶液（1：3
，v/v），然后在PBS中洗涤
。将肺切片与冷块缓冲液一起孵育1小时（2％BSA在1：100 fc-block的PBS中稀释）。然后将切片与Alexafluor 594偶联的抗Ly6g（Biolegend）或兔抗阿洛克15抗体（ABCAM）在PBS中的2％BSA中孵育24小时 。然后 ，将载玻片与山羊抗兔Alexafluor 647偶联抗体（Life Technologies）在室温下孵育1小时。用PBS洗涤载玻片
，并用DAPI（Invitrogen）安装在延长的钻石抗铁中
。使用Zeiss LSM 700激光扫描共聚焦显微镜获取图像。 　　对于成年或PND1小鼠的全肺成像，将动物安乐死 ，并使用1.5％的琼脂糖填充肺部 。打开气管
，并使用25尺寸的针头注射器将琼脂糖添加到肺部
。使用4％PFA过夜去除肺并固定肺部，并使用振动型将肺切成300 µm的截面。使用Alexafluor 647偶联的抗小鼠CD11C ，Alexafluor 594偶联的抗小鼠LY6G和Alexafluor 488偶联的抗小鼠CD331荧光抗体（全部来自Biolegend） 。将样品安装在载玻片上，并使用Leica SP8共聚焦显微镜成像
。 　　将AM接种在玻璃显微镜载玻片（Millipore）的介质室中。将细胞固定在4％PFA中15分钟
，然后通过在PBS中与0.1％Triton X-100孵育或冰冷的甲醇孵育15分钟 。用PBS Triton X-100 0.1％在1小时中用1％牛奶阻止样品，然后在4°C下与特定的兔多克隆抗PSTAT5 ，大鼠抗KI-67或小鼠抗BRDU一起孵育（细胞信号技术
，生命技术或生物防治）
。将细胞与继发抗体Alexa Fluor 555偶联或647个偶联的山羊抗兔或抗小鼠（1：1,000，Invitrogen）和核被DAPI（1：2,000 ，分子探针）染色。将盖玻片安装在显微镜载玻片上（延长钻石抗褪色
，Invitrogen） 。使用Zeiss LSM 700激光扫描共聚焦显微镜获取图像，并使用ImageJ软件进行分析
。 　　在某些实验中 ，使用中性粒细胞富集试剂盒（Stemcell Technologies）分离了PND1和成人WT或Alox15 - / - 小鼠的肺和血液中性粒细胞。将合并的嗜中性粒细胞接种到聚赖氨酸处理的显微镜腔上
，并在室温下用4％PFA固定15分钟 。然后使用Triton X-100 0.1％透化细胞，然后在PBS中的2％BSA中与兔抗阿洛克15抗体（ABCAM）孵育24小时。然后将载玻片与Alexafluor 594偶联的抗Ly6g（Biolegend）和山羊抗兔alexafluor 647偶联抗体（Life Technologies）在室温下孵育1小时
。用PBS洗涤载玻片 ，并用DAPI（Invitrogen）安装在延长的钻石抗铁中。使用Zeiss LSM 700激光扫描共聚焦显微镜获取图像 。 　　使用Verikine小鼠IFNβELISA试剂盒（PBL分析科学）或小鼠IFNβELISA KIT（ABCAM）和垂直小鼠IFNαELISAELISA试剂盒（PBL分析）或IFNα小鼠ELISA ELISA ELISA ELISA KIT（Invitrogen）测量BAL中的IFNβ和IFNα水平
。通过ELISA（R＆D Systems）评估TNF
，CXCL1C，GM-CSF ，TGFβ1，IL-6
，IFNλ和CCL2水平。PGE2，12（S）-HETE ，15（S）-HETE
，Cysteinyl Leukotrienes和LTB4水平由ELISA（Cayman Chemical或ABCAM）确定 。表面活性剂蛋白A ELISA来自Cusabio
。根据制造商的说明，使用蛋白质组小鼠细胞因子阵列套件 ，面板A（R＆D系统）在静息AM上清液（24小时）中测量细胞因子。使用ImageJ分析像素强度 。 　　根据制造商的说明
，使用RNeasy套件（Qiagen）提取来自AMS，PMS和BMDM的RNA
。使用制造商指示的ABM 5X RT Mastermix（ABM）或Lunascript RT Supermix（新英格兰Biolabs）对RNA进行反转录。使用Brightgreen SYBR绿色（ABM）或Powerup Sybr Green（Life Technologies）通过定量PCR生成cDNA 。在补充表2中列出了引物
。使用公式分析了使用CFX96 PCR系统（Bio-Rad）获得的CQ值 ，将靶基因表达归一化为GAPDH。 　　如上所述收集来自WT或Alox15 - / - 小鼠的AM
，并以每50 µL的5×104细胞的密度重悬于 。然后将AM通过气管内途径转移到ALOX15 - / - 小鼠（AM种群，IAV感染模型）或CSF2RB - / - 小鼠（BAL蛋白分析）中。对于IAV感染模型 ，转移后2小时
，将小鼠用IAV PR8感染（50 p.f.u.，intranasasanasasasanasasanasasashashashashashashashashashashashashashashashashansashine）
。如上所述 ，收集和处理BAL组织和肺组织，用于流式细胞仪
，病毒载量或总BAL蛋白含量评估。 　　外源性12-Hete和15-Hete购自开曼化学品 。PND1和PND2 ALOX15 - / - 幼崽或成年小鼠在室内用媒介物，12-HETE或15-HETE（6 µL或25 µL PBS）施用
。 　　TG6-10-1（25 µL或100 µL PBS）和LY255283（5 mg kg-1 in 25 mg kg – 1 in 25 µl或100 µl PBS）购自Cayman Chemicals和腹膜内的PUP（PND0 ，PND0
，PND1或PND1或PND1或成人）。 　　同种型对照（大鼠IgG2a）或抗Ly6g（每只小鼠在25 µL中的50 µg，均来自Biolegend） ，将腹膜内腹膜内腹膜内腹膜内
，PND0，PND1和PND2 WT幼犬 。 　　同种型对照（亚美尼亚仓鼠IgG）或抗FcεR1（每只小鼠100 µg溶液 ，两者都来自生命技术）在pND1和PND2时对WT幼崽进行了鼻室
。 　　对于巨噬细胞生长测定
，将20×104细胞播种在24孔板中，并用20 ng ML – 1重组鼠GM-CSF ，单独或与IL-4（20 ng ml – 1）组合培养3天。然后将细胞用晶体紫染色
，重悬于乙醇中，并在595 nm处读取光密度 。在某些实验中 ，用各种浓度的PGE2（1-10 µM，Cayman Chemical）处理巨噬细胞
。 　　腹膜内注射400 µL Evan的蓝色染料（PBS 2％）。1小时后
，将小鼠安乐死，收集BAL ，并用10 mL PBS灌注肺 。然后
，通过在56°C（肺）的甲酰胺中过夜孵育来提取Evan的蓝色，或在4°C（BAL）中与50％三氯乙酸孵育 ，并使用分光光度计分析使用Evan蓝色的标准曲线在Formamide或50％Trichloroaceticatient的标准曲线中进行定量
。 　　CD45.1+ WT小鼠或CD45.2+ WT或Alox15 - / - 小鼠在3天的抗生素治疗后用9 Gy辐照（0.5 g Enrofloxacin（Bayer）每升饮用水）。After 16 h, the BM compartment was reconstituted with 4 × 106 nucleated cells from either CD45.1+ mice (Alox15−/− or WT CD45.2+ recipient) or Csf2rb−/− or Alox15−/− mice (Alox15−/− or CD45.1+ recipient) and antibiotic treatment was maintained for 2 additional weeks.注射八周后
，将小鼠用于下游测定 。 　　WT，ALOX15 - / - 或CCR2 - / - 小鼠用对照或氯膦酸盐脂质体（70 µL ，鼻内；脂肪瘤BV）处理。通过流式细胞仪在BAL中分娩后的第2天和第14天评估AM种群
。 　　使用SeaHorse XFE 96分析仪（敏捷技术）在XF培养基中测量AMS
，PMS和BMDM的实时OCR。对于线粒体应力测试，线粒体抑制剂寡霉素（1.5 µM） ，氟碳纤维氰化物苯基苯基氢氮酮（FCCP）（1 µM）
，抗霉素A和抗霉素A和紫红酮（0.5 µM）根据制造商的建议使用 。简而言之，将细胞以每个孔的100,000个细胞的密度接种 ，并进行3个基础测量
。此后，每次注射寡霉素
，FCCP和抗霉素A都用烤面包酮进行了两次连续测量。使用Crystal Violet染料提取测定法将所有测量值归一化为细胞数 。使用Wave Desktop 2.3（Agilent Technologies）生成氧气消耗曲线，OCR和ECAR
。 　　从四个WT和四个Alox15 - / - 小鼠的BAL AM中收集大量RNA。使用Illumina Truseq协议构建了测序库 。在Illumina Novaseq（配对端100基对）上对库进行了测序 ，平均每个样品的读数为4260万次
。 　　使用HISAT2（v.2.1.0）39
，所有读取均映射到鼠标基因组（UCSC MM10）（http://www.ccb.jhu.edu/software/software/hisat/index.shtml）39。然后，我们使用htseq-count40使用从UCSC基因组浏览器下载的MM10基因注释GTF文件来量化所有基因的原始计数 。对于所有样品的定量原始计数 ，在我们的研究中
，使用DESEQ2（参考文献41）在WT和Alox15敲除（KO）巨噬细胞之间鉴定差异表达的基因
。DESEQ2还标准化了所有样品的基因表达。归一化基因表达进一步转化为log2空间 。我们从WT（WT0 -WT4）和KO（KO1 -KO4）巨噬细胞中获得了四个重复。WT4的基因表达模式与所有其他WT样品（WT0-WT3）不同（Mann – Whitney U-Test P = 0）
。因此，我们从随后的所有分析中删除了WT4；该决定得到了主要组件分析图（WT4远非图中的其他三个WT样本）。 　　我们还编写了基于JavaScript的Web服务 ，以在不同样本中进行交互绘制基因表达模式
，并在巨噬细胞之间进行统计比较分析（即Mann-Whitney U检验）在不同条件下（例如，与KO相比 ，WT） 。对于任何输入基因（或基因列表）
，Web服务可以自动绘制热图（以样本显示基因表达）和小提琴图（以显示不同样本和条件下巨噬细胞之间的表达差异）
。查询基因（基因列表）的标准化基因表达也可以直接从Web服务下载。Web服务可在http://junding.lab.mcgill.ca/reseach/maziar/genesetenrichment上免费获得，以便于本研究生成的RNA-Seq数据集使用 。 　　我们对鉴定差异基因列表进行了途径富集分析
。我们首先从KEGG数据库42下载了鼠标途径注释。对于给定的兴趣列表 ，我们使用了超几何测试来检查它是否具有特定途径的显着富集（即，该基因列表是否显着富含来自特定KEGG途径的基因） 。校正所有获得的P值以进行多次比较
。 　　从WT和ALOX15 - / - PND1幼崽中收集肺
，然后使用磁分选（Stemcell Technologies）分离总CD45+细胞。使用铬控制器仪器（10倍基因组学）生成乳液中的单细胞凝胶珠（GEM） 。根据制造商的说明，使用铬单细胞3'试剂盒（10x基因组学）制备测序文库
。简而言之 ，在具有以下参数的热循环仪中进行GEM-RT：53°C 45分钟；和85°C持续5分钟。用Dynabeads Myone Silane珠（Thermofisher Scientific）清理cDNA
，并用带有以下参数的热循环蛋白进行放大：98°C持续3分钟；循环12×98°C 15 s;67°C 20 s;72°C持续1分钟；和72°C 1分钟 。使用Spriselect试剂套件进行清理后，通过执行以下步骤来构建库：碎片 ，终端维修
，A尾尾，Spriselect清理 ，适配器连接
，Spriselect清理，样品索引PCR和Spriselect尺寸选择。在Novaseq S2流循环中对库进行了测序
。 　　使用CellRanger（v.3.1.0）43处理RAW FASTQ文件。使用CellRanger的默认参数过滤低计数细胞后 ，分别保留了WT和ALOX15 - / - 样品的7,755和10,098个细胞 。使用SCTRANSFORM44集成了两个数据集
。为了说明细胞死亡的潜在变化和细胞的增殖状态
，我们将线粒体读数的百分比和细胞周期基因的表达水平分别包括在内。使用3,000个高变量基因进行积分，然后降低尺寸runpca（保留20个主成分 ，用于所有依赖分析）和RunuMAP 。降低维度后，使用Findneighbors和Findclusters进行无监督的聚类（分辨率为1）
。 　　由于发育中的小鼠肺细胞的未加入的性质
，采取了一种组合方法来注释所鉴定的不同细胞类型簇。首先，我们使用了预期在成熟的肺部细胞中发现的不同细胞类型的规范标记 。接下来是使用签名基因集的更系统的细胞类型注释
。基因集源自整个Panglao细胞类型标记数据库45 ，它们在使用前被转换为小鼠基因命名法。使用R Package Cell-ID46中所述的过程进行注释 。简而言之
，使用多类超几何测试对参考基因列表进行了SCTRANSFORM归一化计数矩阵
。对于每个细胞，FDR（Benjamini – Hochberg）P值最低的预测类被认为是可能的真实类别。对于此分析 ，大于0.01的P值被认为是模棱两可的 。 　　为了提供更详细的见解
，我们试图进一步描述中性粒细胞异质性。为此，我们利用了以前的单细胞研究46 ，该研究通过其发育来表征不同小鼠外周血中性粒细胞亚群
。从基因表达式Omnibus（标识符GSE137539）下载了原始计数和每条标签。计数是log10归一化的
，然后使用Seurat的归一化函数和Scaledata函数的默认参数缩放基因 。接下来，进行了多个对应分析（MCA和RUNMCA函数）从细胞ID封装中降低维度 ，然后进行getCellgeneset细胞-ID函数
。该过程产生了一系列定义每个中性粒细胞类别的自定义基因列表（n = 200）。再次使用这些列表再次进行细胞注释以获得中性粒细胞亚型预测 。最终的标签是通过通过共识标签分配无监督的簇来完成的
，并在必要时手动策划
。 　　WT和Alox15 - / - 样品之间差异的表征是通过观察带注释的细胞类型之间丰度变化的。我们使用Milo47使用基于邻居的差异测试和可视化进行了这样做 。由于Milo每个条件至少需要两个样本，因此每个样品都被随机分为两个相等的“假示例” ，以使用以下R函数与Milo差异性测试一起使用：≈Condition+Pseudosample
。Plotnhoodgraphda完成了差异性不足的邻域图。 　　ATAC-SEQ在FACS分级新生儿（PND3）和Bal溶解的成年肺泡巨噬细胞上进行 。通过在4°C下以500克离心5分钟，将五万个细胞在冰冷的PBS中洗涤一次
。将细胞重悬于50 µL裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl
，pH 7.4 、10 mM NaCl，3 mM MGCL2和0.1％Igepal CA-630） ，并在4°C下立即在500g下旋转10分钟。将颗粒重悬于转座反应混合物（25 µL 2×TD缓冲液（Illumina
，FC-121-1030），2.5 µl TN5转置（Illumina ，FC-121-1030）和22.5 µL核酸酶的H2O）中
，并在37°C下孵育30分钟 。用QIAGEN MINIELUTE套件纯化DNA，并用Nextera PCR引物（Illumina Nextera Index套件）和Nebnext PCR Master Mix（M0541 ，新英格兰Biolabs）放大。用Qiagen迷你洗脱套件纯化扩增的DNA
。图书馆在芝加哥大学基因组学院的Novaseq测序仪上进行了对端的测序。 　　使用Bowtie2映射到ATAC-SEQ读取到小鼠参考基因组（GRCM38/MM10） 。分别使用samtools“视图 ”和“排序
”对映射读取进行过滤和分类
。使用参数remove_duplicates = true的PICARD MAXDUPLICATES程序删除PCR重复项。随后使用具有参数为-q 0.05和 - keep -Dup的MACS2软件Suite48来调用峰值 。 　　首先通过计算重叠每个称为峰区域的读数的数量（使用来自所有样本的合并峰值文件并在时间过程中复制）首先确定差异访问的峰值
，并确定峰值
。然后，使用R的LIMMA软件包进一步分析了所得计数矩阵（v.4.1.1）。首先通过将所有样品中位数中位数（每百万计数）≤1的人（计数中位数）和重复删除来过滤 。然后 ，我们使用在R软件包EDGER（v.3.34.0）中实现的CalcNormFactors函数在所有样品中进行了归一化的原始计数
，该功能利用TMM算法（M-Values的加权修剪平均值）来计算归一化因子，并且我们使用Limma poffect（v.3.48.3.48.33）使用VOOM函数对数据进行了登录数据
。过滤和归一化后 ，我们使用limma的LMFIT函数对VOOM计算的权重进行了加权拟合。标准化的对数转换计数适合具有以下设计的线性模型：染色质可访问性≈1+年龄+基因型：年龄 。这使我们能够捕获Alox15 KO（基因型）对成人和幼犬独立的峰值可及性水平的影响
。调整后的P值小于0.05的特征被认为是显着的。 　　GSEAs were performed using the R package fgsea (v.1.18.0) with the following parameters: minSize = 15, maxSize = 500, nperm = 100000. To investigate biological pathway enrichments among genes close to differentially accessible peaks, we first assigned all peaks to their nearest gene using the Homer function annotatePeaks with default parameters.然后，我们通过从Limma衍生的峰相关的T统计量来订购基因（见上文）
，并将等级排序的基因列表与MSIGDB集合的Reactome基因集进行了比较（类别= C2，subepategory = cp：cp：reactionome） 。 　　用20 µg LPS在PBS（每只小鼠25 µL）中给小鼠施用小鼠。分娩后1或3天收集BAL和肺进行下游分析
。 　　给出了PND1 ，PND3或成年WT小鼠的静脉注射2 µg FITC偶联的抗CD45.2
，以标记所有循环细胞。三分钟后，将小鼠安乐死并收集肺 ，用BUV395偶联的抗CD45.2抗体染色
，以确定实质（仅用体内抗体标记的细胞）或细胞（细胞用两种抗体标记的细胞） 。 　　如上所述收集了来自WT，ALOX15 - / -  ，ALOX15 - / - 
，ALOX15LOX/LOX和ALOX15LOX/LOXMRP8CRE小鼠，并使用比色的SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒（细胞信号技术）或cellevent serlevent serlevent serlectencencencent Kit（生命技术技术）进行了染色
。 　　对于成像实验 ，使用了6至12周龄的雄性小鼠。通过腹膜内注射氯胺酮（100 mg kg – 1）和甲苯嗪（10 mg kg – 1）来麻醉小鼠 。在成像之前和期间
，在颈内静脉上插管了麻醉的小鼠，以允许静脉注射抗体 ，试剂和其他麻醉药
。通过气管导管将小鼠放置在机械通气上。左肺通过去除两三个肋骨暴露 。带有玻璃滑坡的真空室用于轻轻稳定肺的一部分进行成像
。抗LY6G（克隆1A8，Biolegend）和抗CD31（克隆MEC13.3
，Biolegend）抗体与Alexafluor 647或594荧光染料偶联（每只小鼠7μl），以相差可视化中性粒细胞和流动性。所有肺成像都使用了谐振扫描仪共聚焦显微镜（Leica SP8） 。A×25/0.95水目标镜头用于所有视频成像
。可调的多琳白光激光器同时激发了所需的荧光色素。在相同的时间点记录了来自3个不同视野的视频（每10分钟） ，并在成像实验的2小时内重复 。使用Imaris 9.3处理视频。用Imaris 9.3对细胞行为和簇定量进行分析
。 　　按照制造商的说明
，使用油红O染色套件（ABCAM）对BAL AM进行染色。 　　如前所述49，使用小型动物呼吸机（屈曲设备和屈曲5.1软件）评估气道对甲基醇的反应 。 　　按照制造商的说明 ，使用Phrodo绿色大肠杆菌生物粒子结合吞噬作用（Invitrogen）评估BAL吞噬作用
。使用TECAN板读取器测量荧光。 　　如上所述收集来自幼稚小鼠的BAL
，并使用200 µL确定600 nm的光密度 。 　　麦吉尔大学动物护理委员会（许可证号2010-5860）批准了所有涉及动物的实验，并根据加拿大动物护理理事会规定的指南
。卡尔加里大学动物护理委员会（协议编号AC18-0038）批准了所有用于插入肺内肺成像的动物方案。 　　数据表示为平均值±S.E.M.使用GraphPad Prism v.9.1.2软件（GraphPad）进行统计分析 。使用双面对数秩检验（生存研究） ，单向方差分析（ANOVA）
，然后进行Tukey的多重比较测试，双向ANOVA ，然后进行Sidak或Tukey的多重比较测试
，配对或不纪录的两尾t-tailed t-test t-test test test或两尾曼恩 - 曼恩 - 曼恩 - 曼恩 - Whitney测试，使用了统计差异
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。