与中国人类呼吸道疾病相关的新冠状病毒

　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。　　咳嗽和胸部紧绷感（温度超过37.5°C）的患者被认为是一个可疑病例。在入院期间，收集BALF并将其存储在-80°C下，直到进一步加工。从患者的临床记录中检索了人口统计，临床和实验室数据。这项研究得到了中国疾病控制与预防中心国家传染病控制与预防研究所伦理委员会的审查和批准。从患者那里获得了签名的书面知情同意书。　　按照制造商的说明，使用RNeasy Plus Universal Mini套件（Qiagen）从BALF样品中提取总RNA。使用QBIT机器和Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies）评估RNA溶液的数量和质量。然后，使用智能的总RNA-Seq Kit V.2（Takara）构建RNA库。按照制造商的说明，在图书馆施工期间进行了核糖体RNA耗竭。在Miniseq平台（Illumina）上进行了RNA库的配对端（150 bp读取）测序。图书馆的准备和测序是在中国上海福丹大学上海公共卫生临床中心进行的。　　测序读数是第一个适配器，并使用三型program32进行了质量修剪。剩下的56,565,928读是使用Megahit（v.1.1.3）9和带有默认参数设置的Trinity（v.2.5.1）33组装的。Megahit总共产生了384,096个组装重叠群（尺寸范围为200–30,474 NT），而三位一体产生了1,329,960个重叠群，大小范围为201-11,760 nt。将所有这些组装的重叠群（使用BlastN和Diamond Blastx）与整个非冗余（NR）核苷酸和蛋白质数据库进行了比较，E值分别设置为1×10-10和1×10-5。为了确定测序数据中存在的可能的病因剂，首先评估了组装的重叠群的丰度，因为使用三位一体实施的RSEM Program34的预期计数进行了评估。非人类读取（23,712,657读），通过使用人类基因组（人类版本32，grch38.p13，从gencode下载）通过bowtie235进行过滤宿主读数生成，用于RSEM丰度评估。　　正如Megahit（30,474 nt）和Trinity（11,760 nt）产生的最长的重叠群，两者均与蝙蝠SARS样冠状病毒甲壳虫SL-COVZC45表现出很高的相似之处基因组末端的确认和测定。补充表8中列出了用于PCR，QPCR和种族实验的引物。按照先前所述进行PCR测定法，并按照制造商的指示使用Takara Smarter Race 5'/3'试剂盒（Takara）确定完整的基因组末端。随后，使用Bowtie235和Samtools36将所有适应性和质量构造的读数重新映射到WHCV的整个基因组中，确定了基因组覆盖范围和测序深度。　　BALF中WHCV的病毒载荷通过使用制造商的说明使用Takara One Step Primescrips RT – PCR套件（Takara RRRR064A）通过定量实时RT – PCR确定。在以下条件下使用2.5μlRNA和8 pmol探针进行实时RT-PCR进行实时RT-PCR：在42°C下进行10分钟，95°C逆转录1分钟，然后在95°C的40个循环持续15 s和60°C持续1分钟。通过ABI 7500实时PCR系统进行反应并检测到。使用基于致命的简单快速克隆试剂盒（Tiangen）作为定量病毒载荷测试的标准，将覆盖Taqman引物和探针区域的PCR产物克隆到PLB载体中。　　对于新鉴定的病毒基因组，使用冠状病毒蛋白酶识别的裂解位点的保守特征预测和注释潜在的ORF ，并在Lasergene软件包（V.7.1，DNASTAR）中进行处理。使用MAFFT中实现的L-INS-I算法对齐病毒基因（V.7.407）37。　　然后使用各种COV基因数据集的核苷酸序列进行系统发育分析：（1）整个基因组，（2）ORF1A ，（3）ORF1B，（4）NSP5（3clpro），（3clpro），（5）RDRP（5）RDRP（NSP12），（NSP12），（6）NSP13（6）NSP13（6）NSP13（Hel），（7）NSP11 NSP14（7）NSP14（9）NSP16（O-MT），（10）尖峰（s）和（11）nucleocapsid（n）。使用PHYML程序（v.3.0）38中实现的最大似然法推断系统发育树，使用广义的时间可逆替代模型以及子树修剪和重新布置分支交换。自举支持值是从1,000个伪重复的树计算得出的。使用Mega（V.5）39确定核苷酸取代的最佳拟合模型。使用Lasergene软件包（V.7.1，DNASTAR）中实现的Megalign程序计算序列之间的氨基酸身份。　　使用RDP419和Simpleot（v.3.5.1）40评估了SARBECOVIRAS病史中潜在的重组事件。使用RDP ，Geneconv，Bootscan，最大Chi Square ，Chimera，Chimera，Siscan和3seq方法基于完整基因组（核苷酸）序列进行RDP4分析。通过Bonferroni校正的p值截止值为0.01 ，鉴定出推定的重组事件。使用Simpleot推断出相似图，以进一步表征潜在的重组事件，包括可能的断点的位置。　　使用Muscle41进行了来自WHCV ，SARS-COV和类似BAT SARS的COV的RBD序列的氨基酸序列比对。峰值蛋白RBD的预测蛋白质结构是基于瑞士 - 摩德服务器上的Promod3（https://swissmodel.expasy.org/）上的promod3估算的。通过BLAST搜索WHCV，RS4874和RP3的RBD结构域峰值的序列，以针对瑞士模型模板库中包含的主要氨基酸序列（最后一次更新，2020年1月9日；最后一次更新；上次包括PDB ，包括2020年1月3日）。模型是基于使用Promod3的目标 - 模板对准构建的。使用Qmean评分函数评估了全局和剩余模型质量42。显示了预测蛋白质结构的PDB文件，并将其与SARS-COV（PDB 2GHV）的尖峰RBD的晶体结构（PDB 2GHV）43和与人ACE2（PDB 2AJF）复合的SARS-COV的尖峰RBD结构晶体进行了比较。　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。

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