康复和疫苗血清与SARS-COV-2 Omicron的活性

　　从纵向观察性巴黎的参与者（与SARS-COV-2快速免疫相关的保护）研究中，收集了康复和疫苗后血清
。8,26。该队列自2020年4月以来纵向遵循卫生保健工作者 。该研究得到了西奈山医院机构审查委员会（IRB-20-03374）的审查和批准
。所有参与者在样本和数据收集之前签署了书面同意书。所有参与者都均允许样本银行和共享 。来自巴黎队列的血清样品是这项研究独有的 ，尚未公开可用
。 　　对于Omicron变体的抗原表征
，我们从54名参与者中选择了85种血清样品。54名参与者中有20名是疫苗接种之前的血清调子，而34/54在接种疫苗之前进行了COVID-19（有关人口统计学和疫苗信息 ，请参见补充表1
，2） 。所有患有疫苗接种疫苗免疫力的参与者在2020年感染了纽约都会区循环的祖先SARS-COV-2菌株
。在SARS-COV-2感染的三个月内（平均58天，范围：23–87天）获得康复样品（n = 15） ，而在第二剂剂量后平均收集了23天（范围：14-39天）第二剂量后的疫苗接种样本（n = 40
，20，20 pfizer 2×2×2×2×2×2×范围（范围）（范围：14-33天：辉瑞3×和10个Moderna 3×）疫苗剂量。 　　在Dulbecco的修改后的Eagles培养基（DMEM； Corning ，CAT 。10-013-CV）中培养了表达TMPRSS2（BPS Biosciences
，Cat
。）第78081号（Cat。氨基酸溶液（Gibco，Cat 。编号11130051） ，补充了100 U ML-1青霉素和100μgMl-1链霉素（Gibco，Cat。No
。15140122）
，100μgml-1 Normocin（Inmocin，Cat。No 。ant-Nr）和3μgMl-1 nor-nr-fipulyc piulyc normocin和3μgML
。ant-pr）。在ESF-SFM培养基（表达系统 ，CAT 。No
。98-001）中培养自由泳293-F细胞（Gibco
，Cat。No 。R79007），并补充了100 U ML-1青霉素和100μgml-1-ML-1链霉素（Gibco ，Gibco
，Cat
。15140122）。在expi293表达培养基（Gibco，Cat 。no
。A1435102）中培养了Expi293F细胞（Gibco ，Cat。no 。A14527）
，并补充了100 U ML -1青霉素和100μgMl -1链霉素（Gibco，Gibco ，Cat。15140140122）
。供应商对细胞系进行了身份验证。在实验室一级没有其他身份验证 。定期测试细胞系的支原体
，不含支原体
。 　　西奈山病原体监测计划（IRB批准，第13-00981号HS）从在西奈山卫生系统中寻求护理的患者进行鼻咽拭子标本 ，以筛查新兴病毒变体的患者。诊断完成后，使用已建立的完整病毒基因组测序方法进行了取消识别的生物息胶27（例如
，Beta分离株USA/NY MSHSPSP-PV27007/2021，EPI_ISL_1708926） ，或基于Spike S1突变型材通过Spike S1突变型（OMICIC-ID）（OMICICRON
，MANICRON，MANICRON ，MANICRON
，MANICRON，MANICRON ，MANUS insicron
，MANUS insiCRON，MANUS insiCRON ，MANUS） 。B.1.1.529 USA/NY-MSHSPSP-PV44488/2021（BA.1
，EPI_ISL_7908059）代表了纽约州诊断出的第一个病例之一（女性，年龄 ，年龄，年龄：30-40岁
，30-40岁，Mild Covid-19症状 ，疫苗接种
，并在NOVASER iS SARS 2021
。用作野生型参考（BEI Resources，NR-52281）。补充表3总结了三种病毒分离株中每个菌株的尖峰区域中的氨基酸取代 ，插入和缺失 。 　　通过在培养培养基中添加200μL的病毒传输培养基到Vero.e6-tmprss2细胞来种植病毒
。在4-6天内出现了细胞质效应
，此时通过4,000g离心5分钟来阐明培养上清液。在Vero.E6-TMPRSS2细胞上使用50％的组织培养感染剂量（TCID50）方法对所使用的病毒量扩展进行了对序列验证和滴定 。 　　重组RBD蛋白是使用expi293f细胞（生命技术）生产的
。如前所述，将蛋白质的编码序列克隆到哺乳动物表达载体 ，PCAGGS中
，如前所述为28,29，并在瞬时转染后用每个质粒纯化。使用Expifectamine 293转染试剂盒和纯化的DNA转染了6000万expi293f细胞 。在转染后第四天收集上清液 ，以4,000克离心20分钟
，最后使用0.22 µm滤波器过滤。氮硝基三环酸（Ni-NTA）琼脂糖（Qiagen）用于通过重力流纯化蛋白质，并如前所述洗脱蛋白质 ，如前所述28,29
。使用Amicon离心单元（EMD Millipore）交换缓冲液，并最终将所有重组蛋白重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。还在十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶（5–20％梯度； Bio-Rad）上运行蛋白质
，以检查纯度30,31 。将NTD蛋白构建体（残基1-306）克隆到Sali和Noti核酸内切核酸酶限制位点之间的PVRC8400表达载体中，该位点具有人类鼻病毒（HRV）3C蛋白酶 - 蛋白酶 - 蛋白酶 - 蛋白酶 - 蛋白酶 - 蛋白酶 - 蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶可及的C-末端六刺激蛋白链酰胺和链霉亲蛋白结合蛋白结合蛋白的标记
。NTD在自由泳293-F细胞中瞬时表达。转染后四天 ，通过离心收集上清液
，并使用固定的金属亲和色谱（IMAC）和钴 - 塔隆树脂（Takara）进一步纯化，然后使用SuperDex 200增加10/300 GL尺寸排除柱（GE Healthcare） 。如前所述8
。 　　通过研究级ELISA使用RBD ，NTD和野生型SARS-COV-2的RBD
，NTD和Spike的重组版本以及B.1.351（Beta）（Beta）和B.1.1.529（OMICRON）（请参阅每个Viriantient），使用RBD ，NTD和B.1.351（beta）（beta）（beta）（beta）（beta）（beta）和b.1.351（beta）（beta）和b.1.351（beta）和b.1.351（beta）（beta）
，通过研究级ELISA测量血清中的抗体滴度。所有样品均以盲目的方式进行分析 。简而言之，在4°C下 ，将96孔微滴定板（Corning
，Cat
。No。353227）涂在每孔重组蛋白（2μgml-1）中涂有50μl 。使用自动板垫圈（Biotek 405ts Microplate垫圈），用磷酸盐缓冲盐水（PBS； PBS； Gibco ，Cat
。No。10010-031）洗涤3次 。为了阻止，使用了含3％奶粉的PBS-T（美国生物
，猫。号AB1010901000）
。在室温下孵育1小时后，将阻断溶液除去阻塞溶液 ，并将热灭活的血清（1：100）添加到板上
，然后将其添加到板上，然后将两倍的连续稀释液添加到板上。孵育2小时后 ，将板用PBS-T和50μl洗涤3次
，每孔每孔的二含有二级抗人类IgG（Fab特异性）辣根过氧化物酶（HRP）抗体（在山羊中产生； Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich ，CAT 。添加了
。在室温下孵育1小时后
，将板用PBS-T和Sigmafast O-苯基二氨基二氨基二氯化物（Sigmafast Opd; Sigma-Aldrich; Sigma-Aldrich，Ref。p9187-50set）添加10分钟 ，然后添加10分钟
，随后添加50μlPerper per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per per，添加10分钟 ，添加10分钟 。S25856）停止反应
。使用板读取器（Biotek，Synergy H1微孔板读取器）以490 nm的波长测量光密度。使用Prism 9软件（GraphPad）计算曲线（AUC）值下的面积（AUC）值 。 　　疫苗的血清用于评估野生型（WA1）
，B.1.351（Beta）和B.1.1.529（Omicron）SARS-COV-2分离物（补充表3）的中和
。根据标准安全指南，所有程序均在西奈山伊坎医学院的生物安全3（BSL-3）设施中进行。在完整的Dulbecco的修改后的Eagle培养基（CDMEM）中 ，将Vero.E6-TMPRSS2细胞以每孔的密度为20,000个细胞的96孔高结合细胞培养板（Costar
，Cat 。No
。07620009）中的播种。在最小必需培养基（MEM； MEM； GIBCO，CAT 。编号11430-030）中串行稀释热的血清样品（56°C） ，并补充了2 mm-谷氨酰胺（Gibco
，CaT。No
。25030081），0.1％sodium sodium sodium bicarbonate（w/v）（w/v）（shybon）（shybo）（shyca）（shyca）（shys cat）。10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES; Gibco, cat. no. 15630080), 100 U ml−1 penicillin, 100 μg ml−1 streptomycin (Gibco, cat. no. 15140122) and 0.2% bovine serum albumin (BSA) (MP Biomedicals,猫 。Remdesivir（Medkoo Bioscience Inc
。 ，Cat。No 。329511）作为监测测定变化的对照
。将串行稀释的血清与10,000个WT USA-WA1/2020 SARS-COV-2
，MSHSPSP-PV27007/2021（B.1.351，beta）或USA/NY-MSHSPSP-PV44488/2021（B.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.529 ，OMICRON）孵育10,000 TCID50。病毒 - 体系混合到vero.e6-tmprss2板 。感染在37°C下进行1小时
，并去除接种物
。每个孔的相应抗体稀释液和每孔补充了2％胎牛血清（FBS; Gibco，Cat。No 。10082-1​​47）的感染培养基100μl
。将板在37°C下孵育48小时 ，然后在10％甲醛溶液中以200μl的孔在4°C下固定过夜。为了染色核蛋白，去除甲醛溶液
，并用PBS洗涤细胞（pH 7.4）（Gibco，Gibco ， 猫 。不。10010-031）
，并通过在室温下使用0.1％Triton X-100（Fisher Biereagents，Cat
。No。Bp151-100）加入150μlPBS150μl 。除去透化溶液 ，每孔用200μl的PBS洗涤板（Gibco
，Cat
。No。10010-031），并用PBS封闭 ，在室温下用PBS封闭3％BSA 。去除阻塞溶液
，每孔每孔生物素基化的单克隆抗体1C7C732，这是一种在Icahn Medicine of Medicine of Medicine of Sinai Ismms的ICAHN医学院的治疗抗体开发中心产生的小鼠抗SARS抗SARS核蛋白单克隆抗体（Mounts Sinai Ismms）（MILLIPORE SIGMA ，CAT
。在室温下添加1％BSA 1小时。用200μl每孔的PBS两次洗涤细胞
，并在PBS中稀释的HRP偶联链霉素（Thermo Fisher Scientific）每孔100μL洗涤细胞，在室温下以1：2,000稀释的1小时加入1％BSA 。将细胞用PBS洗涤两次 ，每孔的O-苯基二氨基氨基二羟基二氯化物（Sigmafast OPD； Sigma-Aldrich）在室温下加入10分钟，然后在室温下加入10分钟
，然后在3 M HCl溶液中添加50μl每孔50μL（Thermo Fisher Scientific）
。使用微孔读取器（Synergy H1; Biotek）测量光密度（OD）（490 nm）。使用Prism 7软件（GraphPad）进行分析 。在背景减法和相对于“仅病毒”对照的中和百分比的计算之后，进行了非线性回归曲线拟合分析以计算50％的抑制稀释（ID50） ，顶部和底部约束分别设置为100％和0％
。所有样品均以盲目的方式进行分析。 　　带有Tukey多重比较测试的单向方差分析用于比较中和和RBD结合抗体滴度 。例外是2×BNT162B2 RBD ELISA组
，由于缺少数据点，必须使用混合效应模型。学生的t检验用于比较野生型和Omicron NTD结合数据
。使用Prism 9软件（GraphPad）进行统计分析。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。