疫苗诱导的免疫血栓性血小板尼氏症中的抗体表位

　　没有使用统计方法来预先确定样本量 。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见
。 　　参与者包括被诊断为VITT的患者（n = 5） ，被诊断为HIT（n = 10）和健康志愿者（n = 10）的患者。VITT诊断是基于四个标准：最近的阿斯利康疫苗接种；抗PF4 IgG抗体阳性；PF4增强的SRA阳性；而且没有以前接触肝素 。基于三个标准确认了HIT诊断：4TS评分
，其中所有HIT患者的临床评分至少为4；阳性市售的PF4增强肝素依赖性IgG/A/M特异性EIA（Immucor，OD≥0.45）和阳性SRA（SRA≥20％14C-苏罗替酶释放）27
。这项研究得到了汉密尔顿综合研究伦理委员会（HIREB）的批准 ，并获得了所有参与者的知情书面同意。 　　使用SRA在肝素的存在下进行血小板激活测定
，其中包括一种修饰，其中添加了增加剂量的外源PF4 ，而不是肝素（PF4-SRA）27,28 。一些测定方法是用高浓度的未分离肝素（100 IU ML-1）或FC受体阻滞单克隆抗体（IV.3）进行的
。 　　使用限制位点NDEI和Hindiii（Genscript）将人PF4的全长DNA编码序列克隆到PET22B表达载体中。如前所述5,29
，表达PF4突变体并纯化 。简而言之，设计了PF4突变体 ，从而将野生型PF4中的非丙氨酸氨基酸突变为丙氨酸，并将野生型PF4中的丙氨酸氨基酸突变为Valine。将PF4突变体引入大肠杆菌Arcticexpress（DE3）细胞（Agilent Technologies）中
。对于PF4突变体的过表达
，将培养物在37°C至指定期中期生长，然后用0.5 mM异丙基β-1-1-硫代乳乙型吡喃糖苷（IPTG）诱导 ，并在37°C生长3小时。每种野生型PF4或PF4突变体的大肠杆菌细胞在20 mM磷酸钠
，pH 7.2，400 mM氯化钠 ，1.4 mMβ-苯甲醇
，5％（v/v）甘油，1％（v/v）triton x-x-x-x-00（ther/versosicific）中 ，ph 7.2
，400 mm氯化钠pH 7.2，400 mM氯化钠（pH/v） 。脱氧胆酸（Milliporesigma） ，含2 mM MGCL2
，10μgml-1 dnasei（Milliporesigma）和无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）
。然后通过在40,000克离心40分钟在4°C下清除上清液，并应用于用20 mM磷酸钠 ，pH 7.2，400 mm氯化钠
，1.4 mmβ-碳酸乙醇和5％（v/v）glycerol的HITRAP Q HP柱（Cytiva Life Sciences）均衡。然后将Q HP色谱柱的流通量存储在4°C，过夜 。第二天 ，将血清稀释两倍
，以产生200 mm的氯化钠浓度，磷酸钠 ，pH 7.2
，1.4mmβ-甲醇乙醇和5％（v/v）甘油，Insringe-terterterterterterterterterterterterty pH ，pH 7.2
，1.4 mmβ-氯化钠，并用0.2-μm滤波器（杂技）和载荷上的life colirap separap heparian hp（cyparap sypora）（cyparap comparian hp）过滤
。用0.5 M氯化钠洗脱污染物 ，并用0.5至2 m氯化钠的线性梯度洗脱PF4。将含有纯野生型或PF4突变体的分数合并
，浓缩和缓冲液交换为磷酸盐缓冲盐水（PBS） 和1.5 m氯化钠 。使用二甲酸（BCA）测定法（Thermo Fisher Scientific）确定PF4的浓度
。使用4–18％的denatings sds -page评估每个PF4突变体的蛋白质表达和纯度。 　　测量了70个氨基酸对患者样品中抗PF4-肝素抗体的结合的影响，并以与先前所述的相似方式进行了分析和分析 。使用改良的PF4-HEPARIN IGG特异性EIA5,13测量抗PF4-肝素抗体与野生型PF4和PF4突变体的结合
。将微量定孔板（384孔； Thermo Scientific Nunc）涂上10μgml-1链霉亲和蛋白链霉素和1 IU ML-1生物素基化 - 肝素 ，并用补充3％（V/V）牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭2小时的PBS。然后加入5μgml-1的野生型PF4或PF4突变体，并在环境温度下孵育1小时 。将稀释的患者样品（在PBS中以1％BSA在1％的BSA中制备）在板上添加到板上
，并在室温下孵育1小时。洗涤后，添加了碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG（γ-链特异性 ，杰克逊免疫学实验室）
，以1：3,000的稀释度加入，并在环境温度下孵育1小时
。使用溶于1 M二乙醇胺缓冲液（pH 9.6）中的1 mg ML-1二硝基苯基磷酸（Milliporesigma）底物进行检测。使用Biotek 800TS微板读取器（BioTek）在405 nm和490 nm（作为参考）下测量OD ，以评估抗体与野生型PF4和PF4突变体的结合 。报告结果是相对于野生型PF4结合的结合损失的百分比
。 　　将微量定孔板（96孔
，Nunc Maxisorp）在4°C下涂层，用每孔的PF4（60μgml-1）在50 mM碳酸盐盐盐酸盐缓冲液（pH 9.6）中稀释过夜（60μgml-1）。然后将板用在室温下在PBS中制备的3％（v/v）BSA的200μl封闭板 ，持续2小时 。可用的VITT样品（n = 4）在PBS中以1％的BSA稀释1:50
，并在室温下浓度增加的未分流肝素（最终浓度为0.1 、0.5
、1、1 、5和100 IU ML-1; Pfizer）
。从微定位井板中除去阻塞溶液，并将VITT样品和肝素混合物（每孔100μL）添加到板中 ，然后将其在室温下在板中孵育1小时。将板用PBS – 0.05％Tween 2次洗涤两次
，三次用PBS洗涤 。用碱性磷酸酶偶联的山羊抗人类IgG（γ-链特异性，1：3,000 ，杰克逊免疫研究实验室）在1％（v/v）BSA中固定的人IgG抗体在碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG（γ-链特异性，1：3,000
，杰克逊免疫研究实验室）中检测到
。像以前一样洗涤板，然后加入100μL底物（溶解在二乙醇胺缓冲液（Milliporesigma）中）的100μl底物（二硝基苯基磷酸盐）。使用BioTek 800TS Microplate读取器（BioTek）在405 nm和490 nm（作为参考）下测量OD 。 　　纯化了来自两个VITT样品的总IgG抗体 ，以进一步分析结合动力学
。在室温下用PBS洗涤3次
，将2 ml蛋白G涂层的Sepharose珠（Thermo Fisher Scientific）的体积（Thermo Fisher Scientific）洗涤5分钟。将患者样品在56°C下热灭活30分钟，并在PBS中稀释3次 。然后将样品转移到蛋白质G Sepharose珠中 ，并在室温下孵育1小时
，然后用30 mL PBS进行大量冲洗。总IgG从蛋白质G Sepharose珠中洗脱为0.1 M甘氨酸，pH 2.7 ，并通过Tris Buffer
，pH 8.0中和
。 　　如前所述30，野生型PF4用生物素标记。简而言之 ，将野生型PF4和PF4突变体与5倍肝素Sepharose 6快速流相亲和色谱培养基（Cytiva Life Sciences）孵育1小时
，并在环境温度下摇动 。将EZ-LINK SULFO-NHS-LC-BIOTIN（Thermo Fisher Scientific）添加到PF4中，并以20摩尔过量的形式添加肝素Sepharose混合物 ，并在环境温度下摇动1小时
。使用PBS和2 M氯化钠从肝素表含量从肝素丝氨酸洗脱了生物素化的野生型PF4或PF4突变体。使用分光光度计（Eppendorf AG）测量280 nm处的吸光度，并用于计算浓度 。使用链霉亲和蛋白包被的抗PF4-肝素EIA检查PF4的生物素化
。 　　使用Octet Red 96仪器（Fortébio）进行BLI实验。将样品或缓冲液分配到96孔黑色平底微滴定板（Greiner Bio-One）中
，在补充1％（v/v）BSA的PBS中以每孔为200μl的1％（v/v）BSA，其工作温度保持在23°C 。在PBS（Milliporesigma）中 ，用1％BSA水合链霉亲和素蛋白涂层的生物传感器尖端（fortébio）在抗原固定之前建立基线60 s
。然后将生物素基化的重组PF4（最终浓度7.5μgml-1）单独使用或与0.125 IU ML-1 ML-1未分离的肝素（LEO Pharma）复合
，然后将生物传感器固定在1,200 s的生物传感器上，在1,000 rpm的1,000 rpm上 ，然后在1,000 rpm上进行1,000 s
，然后重建1,000 ,,800 s 1,000,800 s.800， ，800年。然后
，将抗原涂层的传感器与热灭活的患者样品反应或以1:32的稀释为1,000 rpm的1:32稀释780 s，然后在1,000 rpm的1,000 rpm处解离步骤3,000 s 。使用Octet用户软件v.3.1使用2：1异质配体结合模型分析数据
。单独使用缓冲孔中的对照孔的参考值减去 ，并将所有结果比对与测量的基线。每个样品的结合谱响应表示为NM中的平均波长移位 。 　　使用配对或未配对的t检验和Mann-Whitney检验测试了数据之间的差异。据报道
，p值是两尾，p <0.05被认为具有统计学意义
。所有统计分析均使用GraphPad Prism v.9.1.0（GraphPad软件）进行。除非另有说明 ，否则将实验重复两次，并独立两次
，两次与技术重复进行重复 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得
。